調控Smad核轉錄共抑制因子（SnoN）的分子機制與腎纖維化關系的研究.pdf

1、Smad核轉錄共抑制因子(SnoN)作為一種拮抗劑可嚴格調控轉化生長因子-β1/smad(TGF-β1/Smad)信號的活性，從而保證在正常的生理條件下TGF-β1/smad信號輸出的穩(wěn)定性。既往的研究表明在單側輸尿管梗阻術(UUO)后所致的纖維性腎病中SnoN蛋白表達進行性下降；而肝細胞生長因子(HGF)則可通過誘導腎小管上皮細胞特異性表達SnoN從而拮抗TGF-β1的致纖維化作用。但是目前引起SnoN表達變化的調控機制不明。因此本研

2、究探討了在梗阻性腎病中snoN表達下調的分子機制以及HGF引起細胞特異性SnoN表達上調的分子機制。Smad泛素化調節(jié)因子-2(Smurf2)是一種E3泛素鏈接酶，可通過選擇性介導Smad信號途徑中關鍵組分的降解從而在TGF-β信號活性的調節(jié)中起樞紐作用。由于TGF-β信號活性亢進在纖維性腎病的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用，因此，在本研究中我們還探討了Smurf2在纖維性腎病中表達的調節(jié)、其靶蛋白的特異性以及其表達上調的生物學意義。

3、方法： (1)采用結扎雄性CD-1小鼠左側輸尿管的方法建立UUO動物模型，并設假手術小鼠為正常對照組。應用蛋白印跡、Northern印跡和ⅣF-PCR技術，檢測腎組織中SnoN mRNA和蛋白表達水平的變化；并借助蛋白降解和泛素化活性的體外檢測方法，觀察在梗阻性腎病中SnoN蛋白降解率和泛素化活性的變化；并采用免疫組織化學和免疫沉淀技術觀察Smurf2的表達以及與SnoN之間的相互作用，初步探討在梗阻性腎病中SnoN表達變化的分

4、子機制； (2)在人的近曲小管上皮細胞(HKC)中，運用蛋白印跡、RT-PCR、質粒轉染、免疫熒光和RNA干擾等技術進一步探討了TGF-β1引起SnoN表達水平變化的分子機制以及SnoN對TGF-β1致纖維化反應的影響作用； (3)采用HKC細胞為體外觀察系統，應用各種特異的化學抑制劑，通過蛋白印跡、RT-PCR等方法探討HGF誘導SnoN表達上調的細胞內信號轉導途徑；進一步應用染色質免疫沉淀、質粒轉染等技術從基因水平觀

5、察HGF誘導SnoN表達上調的分子機制； (4)采用UUO的方法建立腎小管-間質病變動物模型，并給予外源性HGF處理，通過蛋白印跡、免疫組織化學和免疫熒光染色方法從體內進一步探討HGF誘導SnoN表達上調的分子機制； (5)采用各種原因所致腎病患者的腎活檢組織標本，應用免疫組織化學染色的方法檢測在纖維性腎病中Smurf2表達水平的變化； (6)在HKc細胞中，利用RT-PCR、蛋白印跡等方法探討了TGF-β1對于

6、Smurf2表達的影響及其作用機制； (7)采用質粒共轉染和蛋白印跡分析技術，進一步探討了Smurf2對于RGF-β1/Smad信號轉導途徑中各組分表達的影響；同時以質粒轉染、熒光素酶活性檢測和蛋白印跡分析等技術觀察過度表達Smurf2對于TGF-β1誘導的基因轉錄和纖維化反應的影響。 結果： (1)與假手術組相比，UUO術后7天小鼠腎組織中SnoN蛋白表達水平明顯降低而其mRNA水平保持相對穩(wěn)定，并且SnoN的

7、泛素化活性和蛋白酶體依賴性的蛋白降解率明顯增加；此外，在梗阻性腎病中Smurf2表達增加，并與SnoN形成復合物。 (2)在HKC細胞中，TGF-β1可誘導SnoN蛋白經泛素-蛋白酶體依賴性途徑降解；盡管SnoN可與另一個Smad轉錄共抑制因子Ski形成復合物，且在TGF-β1刺激下，它們可分別與Smad2/3形成三元絡合物，但異位表達Ski并不能影響SnoN的降解率；而且以蛋白酶體抑制劑阻斷SnoN的降解或采用RNA干擾技術下

8、調Smurf2的表達來增加SnoN蛋白表達水平可阻斷TGF-β1誘導的基因轉錄、α-平滑肌肌動蛋白和纖維結合素的表達，提示SnoN的降解是TGF-β1施加其致纖維化反應的必要條件。 (3)在HKC細胞中，HGF誘導的SnoN表達上調發(fā)生在基因轉錄水平，且是由Erk-1/2信號途徑介導的；HGF可快速激活Erk-1/2信號途徑上、下游的信號分子，然后引起核內cAMP反應元件(CRE)結合蛋白(CREB)的活化；染色質免疫沉淀分析結

9、果顯示，HGF可促使CREB和Spl結合到其在SnoN基因啟動子區(qū)中的相關位點上；此外，蛋白印跡分析結果表明HGF僅在HKC細胞中誘導CREB的活化，而在系膜細胞和成纖維細胞中無此作用；而且質粒轉染和特異性化學抑制劑作用的實驗結果也表明CREB的活性和Spl是啟動HGF誘導的細胞特異性SnoN表達上調的必要因素。 (4)體內實驗結果也表明：在梗阻性腎病中，給予外源性的HGF基因可誘導腎組織內Erk-1/2的磷酸化、CREB的活化

10、以及SnoN表達上調。 (5)免疫組織化學染色結果顯示在各種原因所致腎病患者的腎小管中Smurf2表達明顯增加；而在HKC細胞中過度表達SnoN抑制Smad信號活性可完全阻斷TGF-β1誘導的Smurf2表達上調。 (6)質粒共轉染實驗結果提示在基礎狀態(tài)下，過度表達Smurf2可促進Smad2及其核轉錄共抑制因子——SnoN、Ski和TGIF蛋白表達下調，這主要是通過蛋白酶體依賴性蛋白降解的增強而引起的；熒光素酶活性檢測

11、等結果也證實了過度表達Smurf2可增強TGF-β1誘導的基因轉錄、E-上皮細胞鈣粘蛋白表達下調及纖維結合素表達上調。 (7)質粒轉染結果表明過度表達Smad2和Smad3可促進TGF-β1誘導的纖維結合素表達上調；反之，用siRNA技術抑制Smad2和Smad3的表達可阻斷TFG-β1所致的纖維結合素表達上調。因此，提示在腎小管上皮細胞中Smad2和Smad3是TGF-β1誘導的纖維結合素表達上調的必要條件。 結論：

12、 (1)在梗阻性腎病中，SnoN表達水平的下調主要是通過泛素一蛋白酶體依賴性蛋白降解的增強來實現的。 (2)CREB活化和Spl一起觸發(fā)HGF誘導的腎小管上皮細胞特異性SnoN表達上調。 (3)雖然在纖維性腎病腎小管中Smurf2表達特異性上調，而且體外實驗結果也表明TGF-β1可通過Smad信號途徑介導Smurf2表達上調，但由于在腎小管上皮細胞中Smurf2既可引起TGF-β1/Smad信號陽性調節(jié)因子的降解，