云甲斑蝥素靶向抑制PP2Ac抗腎間質(zhì)纖維化的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過TGF-β1體外刺激人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）建立腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞模型，探討:(1) NCTD是否通過靶向抑制PP2Ac發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用;(2) NCTD抗腎間質(zhì)纖維化是否與其抑制PP2Ac介導(dǎo)Smad3-L區(qū)去磷酸化有關(guān)。
　　方法：
　　1、常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，分別通過過表達(dá)PP2Ac和小干擾RNA敲低PP2Ac表達(dá)后，應(yīng)用TGF-β1(5ng/ml)刺激和NCTD(2.5μg/ml)

2、進(jìn)行干預(yù)24h。采用RT-PCR和Western印跡法檢測(cè)PP2Ac、FN、Col-Ⅰ、α-SMA和E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　2、常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，應(yīng)用NCTD(2.5μg/ml)進(jìn)行預(yù)干預(yù)24h和TGF-β1(5ng/ml)刺激1h。采用間接細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)在細(xì)胞的分布，Western印跡法檢測(cè)總蛋白中PP2Ac和核蛋白中pSmad

3、3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞24h致PP2Ac表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，F(xiàn)N、Col-Ⅰ和α-SMA表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，HK-2細(xì)胞纖維化加重;而轉(zhuǎn)染PP2Ac過表達(dá)質(zhì)粒后再用TGF-β1刺激，則PP2Ac表達(dá)上調(diào)更為明顯，HK-2細(xì)胞纖維化加重更顯著;NCTD干預(yù)使PP2Ac表達(dá)下調(diào)，同時(shí)FN、Col-Ⅰ和α-SMA表達(dá)下調(diào)，E

4、-cadherin表達(dá)上調(diào)，HK-2細(xì)胞纖維化緩解;
　　2、小干擾RNA敲低PP2Ac表達(dá)后，F(xiàn)N、Col-Ⅰ和α-SMA表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，HK-2細(xì)胞纖維化緩解;而NCTD與小干擾RNA共同抑制PP2Ac表達(dá)后，對(duì)HK-2細(xì)胞纖維化的緩解程度同單純PP2Ac小干擾RNA干預(yù)組比較無明顯差異;
　　3、免疫熒光結(jié)果顯示，空白對(duì)照組中pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)基本

5、無表達(dá)，TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞1h后pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯增多，NCTD干預(yù)使pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)進(jìn)一步增多。Western印跡結(jié)果顯示，TGF-β1刺激1h使得PP2Ac蛋白表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)pSmad3-L(Ser204)、pSmad3-L(Ser208)蛋白表達(dá)均增多，NCTD干預(yù)使PP2Ac表達(dá)下