Sonic Hedgehog信號(hào)通路與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系的研究.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化(renal interstital fibrosis,RIF)是多種慢性腎臟疾病(chronickidney disease,CKD)的主要病理改變,是最終導(dǎo)致終末期腎臟疾病(end-stage renaldisease,ESRD)的共同通路。RIF的范圍和程度與腎功能減退程度高度相關(guān),因此,改善RIF對(duì)減緩和逆轉(zhuǎn)CKD的進(jìn)程具有重要意義。
　　 RIF的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程主要有以下4個(gè)環(huán)節(jié):①細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控;

2、②炎性細(xì)胞浸潤(rùn);③細(xì)胞增殖和上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT);④細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)異常積聚。在RIF形成過(guò)程中,EMT是指腎小管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞的過(guò)程。ECM在腎間質(zhì)的過(guò)度沉積亦是引起RIF的主要原因,成纖維細(xì)胞作為腎間質(zhì)內(nèi)主要固有細(xì)胞之一,是RIF過(guò)程中最主要的ECM分泌細(xì)胞。研究表明在RIF過(guò)程中,成纖維細(xì)胞的特性可發(fā)生改變,如發(fā)生表型轉(zhuǎn)變,轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞,表達(dá)α-

3、SMA,細(xì)胞表現(xiàn)為增生和分泌能力增強(qiáng)、生成大量ECM。ECM在腎間質(zhì)中產(chǎn)生增多和分解減少造成ECM大量沉積,從而導(dǎo)致RIF,但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。
　　 脊椎動(dòng)物Hedgehog(Hh)家族可分為3個(gè)亞群:Desert Hedgehog(DHh);IndianHedgehog(Ihh);Sonic Hedgehog(SHh)。SHh在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá),Hh信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子包括Glil-33個(gè)異構(gòu)體,Glil即是Hh信

4、號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,又是目的基因,Glil的表達(dá)增加是SHh信號(hào)通路激活的可靠指標(biāo)。近年研究發(fā)現(xiàn)在肝臟、肺臟等多種臟器纖維化過(guò)程中SHh信號(hào)通路發(fā)揮重要作用,且可能同SHh信號(hào)通路上調(diào)Snail1的表達(dá),促進(jìn)EMT有關(guān)。關(guān)于SHh信號(hào)通路與慢性腎臟病的關(guān)系則未見報(bào)道。
　　 目的：
　　 本研究利用RIF動(dòng)物模型單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型,觀察UUO時(shí)SHh信號(hào)通路活化情況,通過(guò)給予SHh通路阻滯劑Cyclopami

5、ne(CPN)或Glil基因敲除阻斷SHh通路,觀察能否減輕RIF,體外培養(yǎng)大鼠腎成纖維細(xì)胞株NRK-49F,予SHh蛋白激活SHh通路,觀察NRK-49F細(xì)胞表型活化及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)情況,同時(shí)觀察給予CPN阻斷SHh通路對(duì)其影響,為防治RIF提供重要的理論依據(jù)和方法。
　　 材料與方法：
　　 1、手術(shù)單側(cè)結(jié)扎輸尿管梗阻性腎病(UUO)動(dòng)物模型的建立
　　 2、UUO小鼠0、3、7、14天腎組織RT-PCR、w

6、estern blot等方法檢測(cè)SHh、Glil表達(dá)
　　 3、應(yīng)用免疫組化及化學(xué)方法檢測(cè)Glil蛋白在UUO小鼠纖維化腎臟中的表達(dá)部位和表達(dá)水平的變化
　　 4、應(yīng)用UUO7天后的小鼠腎組織,實(shí)時(shí)PCR、間接免疫熒光、Masson'strichrome染色等方法檢測(cè)α-SMA、纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原、Snail1表達(dá),觀察Gli1基因敲除鼠與野生型鼠相比,或給予CPN腹腔注射阻斷SHh通路的小鼠與給予安慰劑的小鼠相比,

7、腎間質(zhì)纖維化能否減輕及EMT主要調(diào)節(jié)因子Snail1的變化情況。
　　 5、體外培養(yǎng)大鼠成纖維細(xì)胞株NRK-49F,予人SHh蛋白刺激(不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度),RT-PCR方法檢測(cè)Gli1 tuRN,A的表達(dá),觀察SHh信號(hào)通路能否被激活。分對(duì)照組、SHh組(予人SHh蛋白50ng/ml)、CPN5組(提前給予CPN5uM,30分鐘后予人SHh蛋白50ng/ml)、CPN10組(提前給予CPN10uM,30分鐘后予人SHh蛋白5

8、0n咖1),48h后應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR、間接免疫熒光、Western blot等方法檢測(cè)α-SMA、肌絲蛋白、纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原、Snail1的表達(dá),觀察激活SHh通路能否促進(jìn)大鼠腎成纖維細(xì)胞表型活化、細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)增加,CPN阻斷SHh通路對(duì)其影響,及Snail1mRNA的變化,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用-x±s表示,使用SigmaStat統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析,兩兩比

9、較采用t檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、uuO時(shí)SHh信號(hào)通路激活,SHh、Gli1表達(dá)增加,且隨著UUO時(shí)間的延長(zhǎng),SHh、Gli1表達(dá)增加更明顯(P＜0.05),Gli1在腎間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。
　　 2、與野生型UUO小鼠相比,Gli1基因敲除的UUO小鼠腎間質(zhì)Masson'strichrome染色顯示膠原沉積減輕,無(wú)論實(shí)時(shí)PCR還是間接免疫熒光結(jié)果均表明,UUO側(cè)腎組織

10、α-SMA、Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白表達(dá)下降,同時(shí)伴有Snail1mRNA的表達(dá)減低。
　　 3、與單純UUO小鼠相比,應(yīng)用SHh通路阻滯劑CPN腹腔注射的UUO小鼠,腎間質(zhì)Masson's trichrome染色顯示膠原沉積減輕,UUO側(cè)腎組織α-SMA、Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白表達(dá)下降,同時(shí)Snail1mRNA的表達(dá)也減低。
　　 4、體外培養(yǎng)大鼠腎成纖維細(xì)胞株NRK-49F,予人SHh蛋白刺激,可見Gli1mRNA的表

11、達(dá)呈時(shí)間及濃度依賴性增加,同時(shí)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA、肌絲蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞外基質(zhì)如纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原等表達(dá)上調(diào),同時(shí)Snail1mRNA的表達(dá)亦激活,予CPN阻斷SHh通路,則可抑制SHh的誘導(dǎo)作用,Gli1、α-SMA、肌絲蛋白、纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原、Snail1的表達(dá)呈濃度依賴性下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1、腎間質(zhì)纖維化時(shí)SHh信號(hào)通路激活,Gli1在腎間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。
　　 2、無(wú)