Notch信號通路調(diào)控骨髓來源FSP-1+細胞參與腎間質(zhì)炎癥纖維化的研究.pdf

1、慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）的發(fā)病率及患病率呈逐年遞增的趨勢，已成為威脅公共健康的世界性難題。調(diào)查顯示，西方國家大約有8-10％人口受其影響，而我國CKD患者人數(shù)已超過1億，并且呈現(xiàn)出年輕化發(fā)病趨勢。腎纖維化是慢性腎臟病終末期的共同途徑和病理基礎，其病變嚴重程度和腎功能恢復密切相關。因此，深入剖析腎纖維化的發(fā)病機制，探索腎間質(zhì)纖維化的防治方法已成為腎臟病的研究熱點之一。
　　成纖維細胞特異性蛋

2、白-1（Fibroblast-specific protein1,FSP-1），也被稱為S100A4，是S100的鈣結(jié)合蛋白家族的一員，它從小鼠乳腺癌細胞中分離出來，亦可在骨髓、胸腺、脾臟和淋巴細胞的 mRNA中檢測到。FSP-1表達于腎臟、肺以及心臟等具有組織重塑能力器官的肌成纖維細胞，在正常機體微量表達或不表達，當上皮細胞在病理狀態(tài)下往肌成纖維細胞或腫瘤細胞轉(zhuǎn)變時FSP-1表達增強。故FSP-1已被普通認為是肌成纖維細胞的特異性標記

3、蛋白，并普遍用于鑒定組織纖維化過程中上皮細胞經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）的標志。然而，近年來，越來越多論證開始質(zhì)疑 FSP-1作為成纖維細胞標記蛋白的特異性，而在大鼠腎間質(zhì)炎癥和小鼠腎小球腎炎模型中發(fā)現(xiàn)，大部分FSP-1+細胞表達單核細胞的標記蛋白，這使得FSP-1用于檢測腎臟炎癥反應中肌成纖維細胞或體內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實用性開始被質(zhì)疑，此外，關于FSP-1+細胞在腎纖維化

4、中的調(diào)節(jié)機制的研究也是少有開展。
　　Notch信號通路是生物進化守恒的通路，是細胞發(fā)展、分化、存活及發(fā)揮功能的關鍵調(diào)節(jié)器，在生物基本發(fā)育進程的細胞-細胞交流中起著至關重要的作用。本研究先是通過建立單側(cè)輸尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠模型，運用免疫組化、免疫熒光雙染技術、免疫印跡（Western blot）、RT-PCR技術，觀察FSP-1+細胞在單側(cè)輸尿管梗阻腎組織中的表達

5、情況；再通過免疫熒光技術發(fā)現(xiàn)人體梗阻性腎臟病腎切除術后腎臟組織標本中出現(xiàn)FSP-1+和CD45+細胞浸潤的現(xiàn)象，初步得出和動物實驗相一致的發(fā)現(xiàn)；最后應用GFP-STOPLoxP/LoxP/FSP-1-cre小鼠，將 FSP-1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型（Wild Type，WT）小鼠完成骨髓移植實驗，論證梗阻性腎臟中的FSP-1+細胞主要是骨髓源性的造血細胞，并且觀察到單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型中Notch通道顯著激活，探討了FSP-1+細

6、胞上Notch通道的活化對腎間質(zhì)炎癥與纖維化的影響。
　　目的:
　　1．探討單側(cè)輸尿管梗阻后小鼠腎組織中FSP-1+細胞的分類與來源。
　　2．探討Notch信號通路在FSP-1+細胞內(nèi)的表達及與單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎間質(zhì)炎癥和纖維化的關系。
　　方法:
　　1.（1）雄性野生型 C57BL/6小鼠60只適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機分組的方法分為兩組：假手術組（Sham）和模型組(UUO)，分別于造模成功后的

7、第3天和第7天處死小鼠，其中每批每組小鼠各5只。PAS（ Periodic caid-Schiff,PAS）染色觀察各組小鼠腎臟病理形態(tài)，免疫組化法檢測FSP-1蛋白表達情況；采用小鼠靜脈注射有絲分裂標記物---BrdU的方法，結(jié)合免疫熒光技術檢測腎間質(zhì)FSP-1+細胞增殖情況；Western blot檢測腎組織FSP-1、血小板源性生長因子受體-α（Platelet-derived growth factor receptor-α,P

8、DGFR-α）、纖維連接蛋白（Fibronectin,FN）、增殖細胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）蛋白的表達情況；免疫熒光雙染技術檢測單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型腎組織中FSP-1+分別與α-SMA+、PDGFR-α+、 CD45+以及F4/80+細胞雙染的情況。
　?。?）應用免疫熒光技術觀察人體梗

9、阻性腎臟病腎切除術后腎臟組織標本FSP-1和CD45表達情況。
　　2.（1）將FSP-1啟動子攜帶GFP表達的FSP-1-GFP報道基因小鼠應用于單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型，GFP熒光染色將特異性地標記FSP-1-GFP報道基因小鼠腎組織內(nèi) FSP-1+細胞。應用免疫熒光雙染技術檢測 GFP+與α-SMA+或PDGFR-α+共表達情況；流式細胞技術觀察FSP-1+細胞特性。
　?。?）將 FSP-1-GFP供體小鼠和野生型（W

10、T）小鼠進行骨髓移植實驗：將FSP-1-GFP供體小鼠的骨髓細胞移植給WT小鼠，同時將WT小鼠的骨髓細胞移植給FSP-1-GFP小鼠，之后建立單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化模型。應用免疫熒光技術觀察骨髓移植后各組小鼠FSP-1+和GFP+細胞浸潤情況。
　?。?）RT-PCR技術觀察單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中兩個Notch配體（Jag1和Dll4）、四個Notch受體（Notch1-4）、Hes/Hey家族（Hes1,Hey1和Hey2）

11、三個典型 Notch靶基因以及 Notch信號轉(zhuǎn)錄抑制劑的時序性轉(zhuǎn)錄水平情況；Western blot法檢測NICD（Notch intracellular domain,NICD）和Jagged1蛋白的表達；免疫熒光雙染技術檢測FSP-1+與NICD+細胞共表達情況。
　　結(jié)果:
　　一、單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中FSP-1+細胞的分類和來源
　　1.免疫組織化學法動態(tài)觀察單側(cè)輸尿管梗阻后小鼠腎小管-間質(zhì)中 FSP-

12、1+細胞隨時間增長而數(shù)量增多，各時間點差異比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。BrdU染色結(jié)果顯示 BrdU+細胞主要表達在腎間質(zhì)區(qū)域，單側(cè)輸尿管梗阻后第7天BrdU+細胞數(shù)比第3天增多，F(xiàn)SP-1+與BrdU+雙染細胞數(shù)亦明顯增多，差異比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與假手術組相比，Western blot法檢測顯示梗阻腎組FSP-1、PDGFR-α、FN、PCNA、α-SMA蛋白的表達上調(diào)。以上實驗結(jié)果提示梗阻腎小鼠腎組織中出現(xiàn)FS

13、P-1+細胞浸潤及增殖的現(xiàn)象，且FSP-1+細胞是梗阻腎后腎間質(zhì)增殖的主要細胞類型。
　　2．免疫熒光細胞標記技術發(fā)現(xiàn)梗阻腎小鼠腎臟組織顯示FSP-1和PDGFR-α或α-SMA雙染陽性的細胞非常少，F(xiàn)SP-1+/α-SMA+僅占每高倍視野總細胞數(shù)的2.27%， FSP-1+/PDGFR-α+僅占高倍視野總細胞數(shù)的1.27%，但可見大約60%FSP-1+細胞表達 CD45+造血細胞，同時，出現(xiàn)很大比例巨噬細胞標記物F4/80+與F

14、SP-1+共染陽性的細胞（95.9±0.66%）。提示FSP-1+細胞可表達造血細胞的標記蛋白，F(xiàn)SP-1+并非成纖維細胞的特異性標記蛋白。
　　3.人體梗阻性腎臟病腎切除術后腎臟組織中，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)區(qū)域FSP-1+、CD45+細胞數(shù)量較正常增多，可見FSP-1+/CD45+雙染細胞。提示人體梗阻性腎臟組織中浸潤的FSP-1+細胞可能來源于造血細胞，初步得出和動物實驗相一致的發(fā)現(xiàn)。
　　二、Notch信號通路在 F

15、SP-1+細胞內(nèi)的表達及與單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎間質(zhì)炎癥和纖維化的關系
　　1.利用 FSP-1-GFP報道基因小鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻模型，免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)在間質(zhì)中GFP+/α-SMA+或GFP+/PDGFR-α+共表達陽性的細胞僅占一小部分（GFP+/α-SMA+：3.89%，GFP+/PDGFRα+：5.4%）；分離假手術組及梗阻腎組小鼠腎組織細胞，采用流式細胞技術分析、分選細胞，結(jié)果顯示單側(cè)輸尿管梗阻后第7天腎組織中 FSP-

16、1+細胞的數(shù)量顯著增加，且大部分為造血細胞（約60%FSP-1+細胞為CD45+細胞，F(xiàn)SP-1+/F4/80+巨噬細胞和FSP-1+/CD3+淋巴細胞數(shù)量也顯著增加）；而 FSP-1+/α-SMA+共表達的肌成纖維細胞僅僅占2.5%。以上結(jié)果提示 FSP-1+并非成纖維細胞的特異性標記蛋白，F(xiàn)SP-1+細胞主要為骨髓源性的造血細胞。
　　2.骨髓移植實驗結(jié)果顯示將WT小鼠骨髓移植到FSP-1-GFP小鼠，單側(cè)輸尿管梗阻后小鼠腎組

17、織中絕大多數(shù)間質(zhì)浸潤的細胞為 FSP-1+/GFP-，個別為FSP-1+/GFP+雙染陽性細胞；反之，將FSP-1-GFP供體小鼠骨髓移植到WT小鼠，梗阻腎組織中>95% FSP-1+細胞是GFP+細胞。
　　3. RT-PCR檢測顯示與正常對照組相比，單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中四個Notch受體蛋白（Notch1-4）、兩個配體（Jag1和Dll4）的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)，差異比較具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Weste

18、rn blot檢測顯示梗阻腎小鼠腎組織中Jagged1和NICD表達上調(diào)。以上結(jié)果顯示單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中Notch通道激活，單側(cè)輸尿管梗阻造模損傷后Notch信號在FSP-1+細胞被活化。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)單側(cè)輸尿管梗阻后小鼠第7天腎組織FSP-1與NICD雙染陽性的細胞數(shù)明顯增多。
　　結(jié)論：單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型中間質(zhì)浸潤的FSP-1+細胞主要來源于骨髓-單核巨噬細胞系；梗阻腎組織內(nèi)FSP-1+單核/巨噬細胞中Notch