白藜蘆醇對單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的大鼠腎間質(zhì)纖維化以及sonic hedgehog信號的影響.pdf

1、背景：
　　腎間質(zhì)纖維化(RIF)是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的共同通路，大量的研究表明:RIF是各種細(xì)胞、細(xì)胞因子以及信號通路等諸多因素相互作用共同調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝失衡并異常積聚在間質(zhì)所致。
　　已有研究顯示，Sonic hedgehog(SHH)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)對腎臟的發(fā)育和成熟起重要作用。我們前期研究也已證實，輸尿管梗阻誘導(dǎo)大鼠RIF過程中SHH信號被激活。活化的SHH信號可提高轉(zhuǎn)化生長因子-

2、β1(TGF-β1)的表達(dá)，促進小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)，最終導(dǎo)致ECM成分在間質(zhì)的廣泛累積而引起RIF。因此，闡明腎纖維化的分子機制，對于RIF的有效預(yù)防和治療具有十分重要的臨床意義。近期研究報道，從紅葡萄酒中提煉出來的一種多酚類化合物—白藜蘆醇(Res)具有抑制SHH信號的生物活性。我們推測Res可通過調(diào)控SHH信號通路，抑制EMT進程，進而緩解RIF程度。為證實此假設(shè)，本研究通過建立單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎纖維化模型(UU

3、O)，用Res進行干預(yù)，觀察其對SHH信號、EMT及ECM累積的影響。
　　目的：
　　1.探討Res減輕輸尿管梗阻誘導(dǎo)大鼠腎間質(zhì)纖維化(RIF)的分子機制。
　　2.證實Res可下調(diào)Ⅲ型膠原的表達(dá)，抑制其在腎間質(zhì)的累積，進而緩解RIF進程。
　　3.證實Res可下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)UUO大鼠EMT進程。
　　4.證實輸尿管梗阻大鼠中SHH信號的活化可被Res抑制。
　　5.證實Res可抑制

4、腎組織中包括ECM產(chǎn)生細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖。
　　方法：
　　將40只SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham，n=8)，單側(cè)輸尿管梗阻模型組(UUO，生理鹽水灌胃，n=16)和UUO給藥組（Res灌胃，20 mg·kg-1·d-1，n=16），梗阻術(shù)7d和14d后取其梗阻側(cè)腎臟組織。用以下方法進行檢測:
　　1.蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色觀察腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和RIF程度;
　　2.ELISA檢

5、測腎組織中SHH信號起始蛋白Shh以及促纖維化因子TGF-β1含量;
　　3.免疫組織化學(xué)染色檢測SHH信號分子Shh、Smo、Ptch1和Gli1、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)以及EMT相關(guān)標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Ⅲ型膠原的表達(dá);
　　4.real-time RT-PCR檢測SHH信號分子Smo、Ptch1和Gli1以及EMT相關(guān)基因ZO-1、S100A4、α-SMA和Col3α1

6、 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.Res干預(yù)UUO大鼠后對腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響
　　HE染色結(jié)果顯示，隨梗阻時間的延長，UUO組術(shù)后腎小管擴張逐漸明顯，腎小球逐漸萎縮，同時炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重;Masson染色結(jié)果顯示，間質(zhì)區(qū)面積和膠原相對面積亦逐漸增大，膠原纖維增多。Res干預(yù)后，梗阻所致的腎小管擴張和腎小球萎縮明顯減輕，腎間質(zhì)只有少量膠原纖維累積。
　　2.Res抑制UUO大鼠ECM成分的累積
　　免

7、疫組化結(jié)果顯示，與Sham組相比，Ⅲ型膠原在UUO模型組大鼠梗阻腎間質(zhì)中的表達(dá)明顯升高，并與梗阻時間呈正相關(guān)。Res給藥后，可顯著下調(diào)輸尿管梗阻所致的Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。
　　3.Res對UUO大鼠EMT和TGF-β1表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示，與Sham組相比，隨梗阻時間的延長，α-SMA和Ⅲ型膠原蛋白在UUO模型組大鼠梗阻腎間質(zhì)中表達(dá)明顯升高，而E-cad的表達(dá)明顯減弱。Res給藥后，可顯著下調(diào)輸尿管梗阻所致的α-

8、SMA和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，并且增加了E-cad蛋白的表達(dá)水平。real-time RT-PCR結(jié)果顯示，隨梗阻時間的延長，UUO組大鼠S100A4、α-SMA和Col3α1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，而ZO-1 mRNA表達(dá)水平明顯下降。Res治療后，上述EMT改變被抑制。ELISA結(jié)果顯示，Res治療后，UUO誘導(dǎo)的TGF-β1的高表達(dá)被抑制，并呈濃度依賴性。
　　4.Res對UUO大鼠PCNA表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)

9、果顯示，與Sham組相比，UUO模型組大鼠腎組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比重明顯增加，Res治療顯著降低PCNA陽性細(xì)胞比重。
　　5.Res影響UUO大鼠腎組織中SHH信號通路的活化
　　ELISA結(jié)果顯示，Res治療可降低UUO大鼠Shh水平;免疫組織化學(xué)染色和real-time RT-PCR結(jié)果均顯示，Res下調(diào)Shh、Smo和Gli1 mRNA和蛋白水平，同時也增加Ptch1 mRNA

10、和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　1.輸尿管梗阻后纖維化程度隨著梗阻時間延長而加劇，Res治療能減輕上述纖維化病變。
　　2.輸尿管梗阻可誘導(dǎo)腎組織中Ⅲ型膠原以及細(xì)胞增殖相關(guān)的PCNA呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)，Res的治療可抑制細(xì)胞增殖，阻礙ECM成分合成，進而減輕其在腎間質(zhì)的累積而改善纖維化。
　　3.輸尿管梗阻可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，最終導(dǎo)致ECM成分在間質(zhì)的廣泛累積而引起RIF，Res可能通過抑制TGF-β1從而逆轉(zhuǎn)U