肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要決定因素。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種細(xì)胞因子及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。腎小管間質(zhì)病變及其嚴(yán)重程度往往決定著腎臟疾病的預(yù)后。因此，探討腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制及防治措施具有重要的臨床意義。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor。TGF-β1)在多種纖維化疾病中均發(fā)揮強(qiáng)效的致纖維化作用。TGF-β1通過(guò)促進(jìn)足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)成纖維細(xì)

2、胞產(chǎn)生大量的基質(zhì)成份，.以及腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化，最終發(fā)展成為終末期腎衰竭。活化素受體樣激酶(Activin Receptor-like Kinase)家族，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，特別是ALK5對(duì)于活化的TGF-β1發(fā)揮其生物學(xué)活性至關(guān)重要。提示ALK5與慢性腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ALK5受體能夠活化其下游的Smad及P38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated prot

3、ein kinase P38 MA PK)信號(hào)通路，將TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluarmatrix,ECM)沉積。肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(Hepatocyte growth factor HGF)作為一種多效性因子，對(duì)于腎損傷后腎小管的修復(fù)與再生至關(guān)重要。HGF通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)；抑制成纖維細(xì)胞活化及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度生成；加速細(xì)胞外基質(zhì)降解；阻斷腎小管上皮-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；抑制細(xì)胞凋亡；促進(jìn)細(xì)胞增

4、殖等方面，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。注射用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素(Hepatocyte Growth-promoting Factors for Injection)是從動(dòng)物肝臟中提取的小分子多肽類(lèi)活性物質(zhì)，目前主要應(yīng)用于重癥肝炎和早期肝硬化的臨床治療。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral occlusion,UUO)大鼠模型腎組織HGF、TGF-β1、ALK5表達(dá)影響的研究。本實(shí)驗(yàn)以UUO大鼠模

5、型為研究對(duì)象，觀察腎臟組織病理改變，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HGF、TGF-β1、ALK5的表達(dá)情況，同時(shí)應(yīng)用促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素進(jìn)行干預(yù)，探討腎間質(zhì)纖維化中HGF、TGF-β1，、ALK5的表達(dá)變化及促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)其影響，為臨床防治腎間質(zhì)纖維化提供試驗(yàn)性理論依據(jù)。 方法：選擇清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠54只，體重(200±10)克，隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(正常對(duì)照組，A組)，單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(UUO組，B組)，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素

6、干預(yù)組(C組)，每組各18只。每組又因于術(shù)后第3、7、14天分批處死而分為N3、N7、N14組，每組各6只。將B、C組大鼠以水合氯醛(0.1ml/kg)腹腔注射麻醉后，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左側(cè)輸尿管，在中上1/3處用4號(hào)線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管，以防逆行性感染。A組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其他手術(shù)過(guò)程同前。C組大鼠以促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素0.5mg/(Kg·d)腹腔注射，1次/日；A和B組大鼠用等容積生理鹽水腹腔注射，1

7、次/日，三組均于術(shù)前一天開(kāi)始注射至術(shù)后第3天、第7天和第14天，實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食水。術(shù)后第3天、7天、14天各組隨機(jī)選取6只大鼠分三批頸椎離斷處死，后立即取出大鼠左腎組織，分別用蘇木素伊紅(HE)、Masson染色，光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理變化，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。采用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定腎間質(zhì)HGF、TGF-β1、ALK5的表達(dá)，結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，各組間比較采

8、用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：光鏡下觀察，HE及Masson染色A組未見(jiàn)異常。HE染色可見(jiàn)B組及C組各時(shí)相點(diǎn)大鼠腎臟腎小球均無(wú)明顯變化。B組術(shù)后3天腎小管擴(kuò)張不明顯，可見(jiàn)腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞局灶浸潤(rùn)，腎間質(zhì)寬度增加；第7天腎小管擴(kuò)張明顯，上皮細(xì)胞變性、水腫、甚至壞死，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)寬度明顯增加，偶見(jiàn)萎縮腎小管；第14天上

9、述病變加重，可見(jiàn)彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小管基底膜不同程度斷裂，皮質(zhì)及外髓萎縮的腎小管較多，間質(zhì)中大量淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化較明顯。Masson染色可見(jiàn)B組術(shù)后3天腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)寬度增加，膠原纖維增加，染色加深；此后，病變逐漸加重。C組與B組平行相比腎小管間質(zhì)病變程度明顯減輕，腎間質(zhì)相對(duì)面積明顯減少(P＜0.05)。三組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：TGF-β1在A組在腎小管間質(zhì)、腎小球微量表達(dá)。

10、在B組各時(shí)相點(diǎn)TGF-β1的表達(dá)隨時(shí)間呈進(jìn)行性升高，且隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸上調(diào)。B組組間及與A組同時(shí)相點(diǎn)相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。C組術(shù)后第3天、第7天、第14天TGF-β1的表達(dá)均顯著低于同時(shí)期B組的表達(dá)(P＜0.05)，但仍高于同期A組(P＜0.05)。ALK5在A組各時(shí)期均幾乎無(wú)表達(dá)。在B組主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，腎間質(zhì)有少量表達(dá)，隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，腎間質(zhì)纖維化程度的加重，ALK5的表達(dá)逐漸增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

11、0.05)。C組與B組同時(shí)相點(diǎn)相比ALK5的表達(dá)均減少，組間、組內(nèi)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。HGF在A組各時(shí)期均幾乎無(wú)表達(dá)。在B組主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，于第3天表達(dá)最高，第7天稍有回落，第14天表達(dá)最弱，但均高于同期A組(P＜0.05)。與同期B組相比，C組術(shù)后第3天、第7天、第14天HGF的表達(dá)均顯著高于同時(shí)期B組的表達(dá)(P＜0.05)。 結(jié)論：在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)中TGF-β1、ALK5的表達(dá)明顯升高，且隨著