肝再生增強(qiáng)因子對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 ALR對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制
　　目的:肝再生增強(qiáng)因子(ALR)在缺血再灌注大鼠中表現(xiàn)出明顯的腎臟保護(hù)作用，但其是否參與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)病理過(guò)程，目前尚不清楚。本研究擬通過(guò)建立腎小管EMT細(xì)胞模型，觀察ALR是否參與EMT的病理過(guò)程，并探討外源性給予重組人ALR(rhALR)對(duì)腎小管EMT的影響及其機(jī)制。
　　方法:建立轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的腎小管EMT細(xì)胞模型，先檢測(cè)細(xì)

2、胞內(nèi)源性ALR蛋白及mRNA表達(dá)，再將細(xì)胞分為五組:①正常對(duì)照組;②單純r(jià)hALR處理組;③單純TGF-β1刺激組;④TGF-β1+20μg/ml rhALR處理組;⑤TGF-β1+80μg/ml rhALR處理組。酶聯(lián)免疫法(ELISA)法檢測(cè)培養(yǎng)上清液和胞質(zhì)中的TGF-β1含量;蛋白免疫印跡和免疫熒光激光共聚焦檢測(cè)上皮標(biāo)記物E-鈣粘蛋白及（?。┏衫w維細(xì)胞標(biāo)記物α平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞E-鈣粘蛋白和

3、波形蛋白mRNA水平;蛋白免疫印跡檢測(cè)TGF-β1受體Ⅰ(TβRⅠ)、TGF-β1受體Ⅱ(TβRⅡ)及其下游Smads蛋白（Smad2、Smad4、Smad6、Smad7及磷酸化Smad2）、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和磷酸化NF-κB表達(dá)。
　　結(jié)果:蛋白免疫印跡檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組比較，TGF-β1刺激組NRK-52E細(xì)胞內(nèi)源性ALR蛋白及mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）;ELISA檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組

4、比較，單純ALR處理組NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)上清液和胞漿中TGF-β1的含量無(wú)顯著差異(P＞0.05);蛋白免疫印跡檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組比較，TGF-β1刺激組NRK-52E細(xì)胞E-鈣粘蛋白表達(dá)顯著下降，而波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)顯著上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與TGF-β1刺激組比較，TGF-β1+rhALR處理組E-鈣粘蛋白表達(dá)上升，而波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）

5、;蛋白免疫印跡檢測(cè)顯示，與正常對(duì)照組比較，單純r(jià)hALR處理組NRK-52E細(xì)胞TβRⅡ受體表達(dá)顯著下降(P＜0.05)，而TβR-Ⅰ受體、Smad2、Smad4、Smad6、Smad7蛋白及磷酸化Smad2、核因子NF-κB無(wú)顯著差異(P＞0.05);與單純TGF-β1刺激組比較，TGF-β1+rhALR處理組細(xì)胞磷酸化Smad2和磷酸化NF-κB水平顯著下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論:ALR參與了腎小管EMT病理過(guò)程，rhA

6、LR可通過(guò)下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞TβRⅡ受體表達(dá)、影響Smad2磷酸化水平及核因子NF-κB轉(zhuǎn)錄，從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管EMT。
　　第二部分 ALR對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響及機(jī)制
　　目的:我們的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhALR有抑制腎小管EMT的作用，那么，其是否在體內(nèi)對(duì)腎間質(zhì)纖維化存在影響呢？目前尚未知。本部分，擬通過(guò)建立腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，觀察rhALR對(duì)腎間質(zhì)纖維化的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　方法:建

7、立大鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型，60只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為四組:①假手術(shù)組(n=15);②UUO模型組(n=15);③UUO+低劑量rhALR（100μg/kg.d）處理組(n=15);④UUO+高劑量rhALR(200μg/kg.d)處理組(n=15)。四組大鼠分別于術(shù)后第3、7、14天分批處死，留取手術(shù)側(cè)腎臟組織。分別采用HE和Masson染色觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠梗阻側(cè)腎臟組織形態(tài)學(xué)改變;蛋白免疫印跡及免疫熒光激光共聚焦檢測(cè)腎臟

8、內(nèi)源性ALR蛋白表達(dá);蛋白免疫印跡檢測(cè)腎臟組織E-鈣粘蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白、膠原Ⅰ蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腎臟組織波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白、膠原Ⅰ蛋白mRNA表達(dá);蛋白免疫印跡檢測(cè)腎臟組織TGF-β1、Smad-2、Smad-3及磷酸化Smad-2、-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:蛋白免疫印跡及免疫熒光激光共聚焦檢測(cè)顯示，與假手術(shù)組比較，UUO模型組梗阻3天、7天大鼠腎臟內(nèi)源性ALR表達(dá)顯著

9、增加(P＜0.05)，與梗阻7天比較，梗阻14天大鼠腎臟內(nèi)源性ALR表達(dá)顯著下降（P＜0.05）;與UUO模型組比較，rhALR處理組大鼠梗阻側(cè)腎臟Masson染色纖維化評(píng)分顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）;蛋白免疫印跡檢測(cè)顯示，與UUO模型組比較，rhALR處理組大鼠梗阻腎臟E-鈣粘蛋白表達(dá)上升，而纖連蛋白、膠原Ⅰ蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與UUO模型組比較，rhALR處理組大鼠梗阻腎臟TGF-β1表達(dá)顯著

10、下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，與UUO模型組比較，rhALR處理組大鼠梗阻腎臟波形蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、纖連蛋白、膠原Ⅰ蛋白mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）。蛋白免疫印跡顯示，與假手術(shù)組比較，UUO模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟磷酸化Smad-2和磷酸化Smad-3表達(dá)顯著升高（P＜0.05）;與UUO模型組比較，rhALR處理組大鼠梗阻腎臟磷酸化Smad-2和磷酸化Smad-3表達(dá)顯著減少（P＜0.05