調(diào)控肝細胞轉(zhuǎn)錄因子FOXA2表達影響肝纖維化進程.pdf

1、目的:
　　在本研究中我們首先通過檢測人肝硬化組織中FOXA2的表達水平，以及CCl4模型小鼠不同程度肝纖維化的肝組織、肝細胞和HSCs中FOXA2表達變化，探索FOXA2表達與肝纖維化的相關性;利用不同載體上調(diào)肝臟、肝細胞和HSCs的FOXA2表達水平，檢測對肝纖維化的作用;利用特異性敲除肝細胞FOXA2小鼠觀察對肝纖維化的影響;最后通過基因芯片篩選差異基因，明確FOXA2對肝細胞基因表達譜的影響，初步闡述調(diào)控肝細胞FOXA2表

2、達影響肝纖維化的分子機制，為臨床治療肝纖維化提供新的靶點和思路。
　　方法:
　　一、檢測FOXA2在肝纖維化中的表達特點
　　1、利用免疫組織化學法檢測正常人和肝硬化患者肝組織中FOXA2表達差異。
　　2、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫組織化學法檢測CCl4模型不同時間點小鼠肝臟FOXA2表達變化。
　　3、利用Real-time RT-PCR和Western bl

3、ot法檢測正常小鼠與CCl4模型小鼠肝細胞中FOXA2表達差異。
　　4、利用Real-time RT-PCR和Western blot法檢測CCl4模型不同時間點小鼠HSCs中FOXA2表達變化。
　　二、上調(diào)肝臟FOXA2表達對肝纖維化的作用
　　1、通過慢病毒過表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP構建FOXA2過表達質(zhì)粒pCDH-FOXA2，利用包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G包裝慢病毒LV-

4、FOXA2，鑒定后通過尾靜脈注射至CCl4模型小鼠。
　　2、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫組化法檢測FOXA2組小鼠與對照組中FOXA2、CollagenⅠ和α-SMA的表達變化。
　　3、使用H&E和天狼星紅染色法評估各組小鼠肝臟病理學變化，并使用軟件進行膠原定量。
　　4、利用羥脯氨酸試劑盒檢測各組小鼠肝臟中羥脯氨酸含量。
　　5、利用Real-time RT-PCR法

5、檢測各組小鼠肝組織炎癥指標IL-6、TNF-α和TGF-β1的表達變化。
　　三、上調(diào)肝細胞FOXA2表達對肝纖維化的影響
　　1、通過腺相關病毒載體pENN.AAV.TBG.PI.RBG構建可特異性上調(diào)肝細胞的FOXA2過表達質(zhì)粒pAAV8-TBG-FOXA2，包裝為腺相關病毒后，通過尾靜脈注射至CCl4模型小鼠。
　　2、經(jīng)尾靜脈分別注射AAV8-TBG-FOXA2和對照病毒至正常小鼠，分離小鼠原代肝細胞和其他細胞

6、，利用Real-time RT-PCR和Western blot法鑒定腺相關病毒AAV8-TBG-FOXA2的特異性。
　　3、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫組化法檢測FOXA2組小鼠與對照組中FOXA2、CollagenⅠ和α-SMA的表達變化。
　　4、使用H&E和天狼星紅染色法評估各組小鼠肝臟病理學變化，并使用軟件進行膠原定量。
　　5、利用羥脯氨酸試劑盒檢測各組小鼠肝臟中羥

7、脯氨酸含量。
　　6、利用Real-time RT-PCR和免疫組織化學法法檢測各組小鼠肝組織炎癥指標IL-6、TNF-α和TGF-β1的表達變化。
　　四、敲除肝細胞FOXA2表達對肝纖維化的影響
　　1、通過對FOXA2loxp小鼠進行雜交、繁殖并鑒定出純合子FOXA2loxP/loxP小鼠，利用AAV-TBG-Cre特異性敲除肝細胞FOXA2，并進行CCl4造模。
　　2、利用Real-time RT-PC

8、R、Western blot和免疫組化法檢測FOXA2敲除組小鼠與對照組中FOXA2、CollagenⅠ和α-SMA的表達變化。
　　3、使用H&E和天狼星紅染色法評估各組小鼠肝臟病理學變化，并利用軟件進行膠原定量。
　　4、利用羥脯氨酸試劑盒檢測各組小鼠肝臟中羥脯氨酸含量。
　　五、上調(diào)HSCs中FOXA2表達對肝纖維化的作用
　　1、通過慢病毒載體pLVX-GFAP-IRES-ZsGreen構建可特異性上調(diào)星

9、狀細胞的FOXA2過表達質(zhì)粒pLVX-GFAP-FOXA2，包裝為慢病毒并濃縮純化后，通過尾靜脈注射至正常小鼠，一周后注射CCl4復制肝纖維化模型。
　　2、分離已注射慢病毒LVX-GFAP-FOXA2的正常小鼠的原代肝細胞和HSCs，利用Real-time RT-PCR法鑒定慢病毒LVX-GFAP-FOXA2的特異性。
　　3、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫熒光法檢測FOXA2組小鼠與

10、對照組中FOXA2、CollagenⅠ和α-SMA的表達變化。
　　4、使用H&E和天狼星紅染色法評估各組小鼠肝臟病理學變化。
　　六、上調(diào)肝細胞FOXA2表達對CCl4模型小鼠肝細胞表達譜的影響
　　1、利用可特異性上調(diào)肝細胞FOXA2的腺相關病毒AAV8-TBG-FOXA2經(jīng)尾靜脈注射至CCl4模型小鼠，分離小鼠原代肝細胞后抽提細胞總RNA，鑒定后進行基因芯片雜交實驗。
　　2、利用DAVID Online

11、Tools Suite網(wǎng)站工具，查詢The Gene Ontology(GO)、KEGG、BIOCARTA、BBID等數(shù)據(jù)庫，獲取基因功能分類信息及歸屬信號轉(zhuǎn)導通路信息。
　　七、統(tǒng)計學處理
　　數(shù)據(jù)以X± SD表示，用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05有顯著差異，P＜0.01有非常顯著差異。
　　結果:
　　一、FOXA2表達與肝纖維化進程成負相關
　　二、非特異性上調(diào)肝臟FOXA2可改

12、善肝纖維化
　　三、特異性上調(diào)肝細胞FOXA2可改善肝纖維化
　　四、特異性敲除肝細胞FOXA2可促進肝纖維化
　　五、特異性上調(diào)星狀細胞FOXA2對肝纖維化無影響
　　六、上調(diào)肝細胞FOXA2表達影響CCl4模型小鼠肝細胞基因表達
　　結論:
　　1、FOXA2在肝纖維化組織及肝細胞中表達下調(diào)，而在HSCs中表達上調(diào)。
　　2、過表達肝臟FOXA2可改善小鼠肝纖維化。
　　3、特異性敲除