姜黃素衍生物對(duì)肝纖維化小鼠核因子-κB表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的:
　　肝纖維化(Hepatic fibrosis)是指肝細(xì)胞壞死或者變性時(shí)，肝臟內(nèi)的纖維結(jié)締組織異常的增生而分解減少的過程[1，2]。肝纖維化是發(fā)展成肝硬化的一個(gè)必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)，可進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重危害人類的健康。肝纖維化在各種因素的損傷下，正常結(jié)構(gòu)受到破壞，肝細(xì)胞變性壞死，肝小葉和血管等被改建。目前已證實(shí)了肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)[3]。病毒性肝炎或酒精性肝炎等原因都可導(dǎo)致肝臟纖維化。要是這些病因持續(xù)存在，纖維化會(huì)逐

2、步加重，可出現(xiàn)纖維條索之間相互連接，形成完整的間隔，假小葉形成并慢慢形成肝硬化。因此，對(duì)肝纖維化機(jī)制的研究，成了研究領(lǐng)域的熱門。
　　姜黃素(Curcumin)具有抗炎[4]、抗糖尿病[5]、降膽固醇[6]、抗氧化[7]及抗腫瘤[8]等作用，來自中藥姜黃素根莖。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明姜黃素對(duì)許多疾病都具有一定的抗炎作用，姜黃素可以通過產(chǎn)生炎癥因子達(dá)到降低炎癥反應(yīng)的目的，包括支氣管炎、動(dòng)脈粥樣硬化、帕金森[9,10]、癲癇[11，12]

3、、炎性腸病[13]、自身免疫性疾病，糖尿病腎病[14]等。
　　C66是姜黃素新型的類似物，通過研究證明其具有和姜黃素相同的作用，且生物利用度有大幅度的提高[15]。目前已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素衍生物C66能保護(hù)糖尿病小鼠腎臟，能明顯減輕糖尿病小鼠的腎功能損傷以及緩減腎臟病理結(jié)構(gòu)的改變。該實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射四氯化碳(CCL4)致小鼠肝纖維化模型，予以C66治療，并觀察C66的抗肝纖維化效果及其可能的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　

4、健康的雄性C57BL/6J小鼠33只。隨機(jī)選取9只小鼠作為正常對(duì)照組，給予普通飼料和自來水，余下24只小鼠于腹腔注射40％ CCL4混合液，首次為4ml/kg，此后為2ml/kg，每周2次，連續(xù)6周。于造模6周末隨機(jī)選取6只小鼠，取肝右葉以4％多聚甲醛固定，制成肝組織石蠟切片并行病理學(xué)檢測，判斷造模是否成功。模型建成后，隨機(jī)將造模小鼠均分成模型對(duì)照組（9只）和C66治療組(9只)。第6周開始，模型對(duì)照組和C66治療組繼續(xù)造模，同時(shí)給予治

5、療組C6610mg/kg/d灌胃，其余組均給予等量的0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，連續(xù)6周。第12周末，各組小鼠以水合氯醛麻醉，摘眼球取血，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。取適量肝左葉組織，用于測定羥脯氨酸(Hyp)含量。取適量肝右葉，石蠟包埋，行HE染色及Masson染色，觀察其組織學(xué)變化，并進(jìn)行肝纖維化半定量評(píng)分;另取余下肝組織于-80℃冰箱凍存。采用RT-PCR檢測膠原Ⅰ(Colla

6、genⅠ)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)mRNA表達(dá)情況。Western免疫印跡法檢測各組CollagenⅠ、α-SMA及核因子-κBp65(NF--κBp65)、核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)的蛋白表達(dá)情況。采用單因素方差分析比較樣本均數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.觀察小鼠一般情況:正常對(duì)照組小鼠生長良好，體型豐滿，毛發(fā)順滑，進(jìn)食好且活躍;模型對(duì)照組小鼠發(fā)育和周齡不相符，消瘦，毛發(fā)稀疏，進(jìn)食差，反應(yīng)遲鈍;C66治療組狀

7、態(tài)較正常對(duì)照組稍差，和模型對(duì)照組相比有明顯的改善，形體較豐滿，毛發(fā)尚光澤，進(jìn)食較好，反應(yīng)尚可。在這期間，正常對(duì)照組均存活，模型對(duì)照組小鼠死亡2只，C66治療組小鼠死亡1只。
　　2.肝臟大體形態(tài):正常對(duì)照組肝臟軟而細(xì)膩，邊緣光整，無異常改變;模型對(duì)照組小鼠剖腹后部分可觀察到少量腹水，肝臟肉眼觀察部分表面有小結(jié)節(jié)，肝臟體積明顯縮小，質(zhì)地變硬，邊緣變鈍，與周圍器官粘連廣泛;C66治療組剖開腹腔后未能觀察到腹水，肝臟肉眼觀察體積縮小，邊

8、緣變鈍，質(zhì)地變硬，表明未見明顯結(jié)節(jié)，與周圍器官無明顯粘連。
　　3.肝臟病理學(xué)改變:正常對(duì)照組小鼠HE染色在光鏡下可見肝結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞無變性、壞死;模型對(duì)照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)被破壞，可見炎性細(xì)胞大量浸潤，纖維組織增生形成典型的假小葉;C66治療組的肝細(xì)胞變性壞死程度和模型對(duì)照組相比有明顯的減輕，纖維沉積減少明顯，未見明顯的假小葉形成。
　　正常對(duì)照組小鼠Masson染色在光鏡下可見肝結(jié)構(gòu)完整，未見明顯的纖維組織增生;模型對(duì)照

9、組可見肝結(jié)構(gòu)被破壞，伴有炎性細(xì)胞浸潤，纖維條索相互連接成完整的纖維間隔，部分可見典型的假小葉;與模型對(duì)照組組相比，C66治療組肝細(xì)胞變性、壞死程度較輕，可見明顯的纖維增生但無典型的假小葉形成。
　　4.肝功能ALT和AST檢測:模型對(duì)照組ALT、AST水平分別為(202.71±19.66) U/L和(233.42±23.97) U/L，C66治療組分別為(102.00±11.04)U/L和(120.87±13.83)U/L，正常對(duì)

10、照組分別為(36.66±6.37)U/L和(43.33±8.08) U/L。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較(t值分別為23.96和22.39，均P＜0.05)，C66治療組與模型對(duì)照組比較(t值分別為11.56和10.52，均P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.肝臟Hyp檢測:模型對(duì)照組肝組織Hyp含量與正常對(duì)照組比較（t=17.50，P＜0.05），C66治療組肝組織Hyp含量與模型對(duì)照組比較（t=11.45，P＜0.05

11、），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot:C66治療組CollagenⅠ和a-SMA mRNA表達(dá)明顯下降，與模型對(duì)照組比較（t值分別為7.23和7.95，均P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型對(duì)照組相比，C66治療組Collagen-Ⅰ、α-SMA、NF-κBp65蛋白表達(dá)下調(diào)，同時(shí)IκBα蛋白表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯