姜黃素對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用及表觀遺傳學(xué)機(jī)制.pdf

1、背景：
　　姜黃素(Curcumin)為姜黃的主要活性成分之一，具有抗肝纖維化(hepaticfibrosis，HF)作用，但具體機(jī)制不詳細(xì)，可能與抗氧化、抗炎、清除自由基有關(guān)。現(xiàn)有研究表明，在HF組織中，纖維化相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)及表達(dá)水平均表現(xiàn)出較明顯的差異。但姜黃素是否能夠通過(guò)影響肝纖維化相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)來(lái)發(fā)揮抗HF的作用尚不清楚。本課題擬在體內(nèi)外模型中探討姜黃素對(duì)肝纖維化相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)的影響，可望發(fā)現(xiàn)姜黃素抗HF

2、的新機(jī)制。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組:SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠18只，4-6周齡，隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(FC)、模型組(FM)和姜黃素組(FJ)，每組6只。
　　2.肝纖維化模型的建立及姜黃素干預(yù):FM和FJ組按0.6 ml/kg的劑量腹腔注射四氯化碳(CC14)，每周2次，連續(xù)6周;FC組腹腔注射等體積的橄欖油作為對(duì)照。同時(shí)，F(xiàn)J組每只鼠按姜黃素200 mg/kg劑量灌胃，每日一次，連續(xù)6周，F(xiàn)C和F

3、M組灌胃等體積的PBS作為對(duì)照。
　　3.標(biāo)本收集:末次CCl4腹腔注射48 h后處死小鼠，采集外周血和肝組織，分別檢測(cè)小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平和肝臟病理學(xué)形態(tài)。肝臟組織提取DNA，檢測(cè)甲基化;提取RNA和蛋白，Real time PCR和Westen Blot檢測(cè)α-SMA、Col1a1和DNMT的表達(dá)。
　　4.甲基化譜的篩選及鑒定:通過(guò)Roche-NimbleGen小鼠MeDIP-chip

4、技術(shù)，篩選三組小鼠肝臟組織的甲基化差異基因，進(jìn)一步做gene ontology(GO)分類和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信號(hào)通路分析;對(duì)8個(gè)代表性基因（Camk4、Fgfr3、FZD10、Gpx4、Hoxd3、Nfkb2、Prkcb、Tcfeb）進(jìn)行MeDIP-qPCR驗(yàn)證。
　　5.姜黃素處理大鼠肝星狀細(xì)胞（HSC-T6細(xì)胞），分為三組:對(duì)照組，TGF-β1誘導(dǎo)組，姜

5、黃素處理組;檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期，α-SMA、Col1a1和DNMT的表達(dá)，Camk4、FZD10、Gpx4和Hoxd3基因甲基化。
　　6.所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS16.0軟件，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)描述使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間的差異分析使用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，三組及以上的差異分析使用單因素方差分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠血清ALT與AST水平:FC、FM和FJ三組小鼠ALT分別為:（

6、23.0±1.55）U/mL、（2485.8±362.85）U/mL、(386.93±33.02) U/mL; AST分別為:(100.8±9.98) U/mL、(1593.8±303.2) U/mL、(322.2±47.56) U/mL，F(xiàn)M組小鼠血清ALT及AST水平較FC組明顯增高，而姜黃素能明顯降低肝纖維化小鼠血清ALT及AST水平。
　　2.肝臟組織形態(tài):FC組肝小葉和匯管區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞完好，匯管區(qū)和匯管區(qū)四周

7、未出現(xiàn)小膽管和增生的纖維組織;FM組見(jiàn)肝細(xì)胞大量壞死，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝組織內(nèi)膠原纖維明顯增多，肝小葉纖維間隔形成;FJ組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，肝組織纖維沉積較FM組明顯減輕。
　　3.α-SMA、Col1a1和DNMT1表達(dá):Real time PCR和Western blot提示，F(xiàn)M組α-SMA、Col1a1和DNMT1表達(dá)較FC組明顯增多，F(xiàn)J組與FM組比較，β-SMA、Col1a1和DNMT1表達(dá)均下降

8、。
　　4.甲基化芯片結(jié)果:根據(jù)FC組低甲基化，F(xiàn)M組高甲基化，共篩選934個(gè)甲基化差異基因。根據(jù)FJ組低甲基化，F(xiàn)M組高甲基化，選擇了甲基化差異基因共550個(gè)。其中有75個(gè)屬于兩者重合部分，完成GO、KEGG信號(hào)分析，可見(jiàn)其主要涉及細(xì)胞過(guò)程調(diào)節(jié)、生物學(xué)過(guò)程調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝過(guò)程、發(fā)育過(guò)程等;信號(hào)通路最常見(jiàn)的依次為:腫瘤相關(guān)通路、NK-kappa B信號(hào)、MAPK信號(hào)、Wnt信號(hào)通路、NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用等。在75個(gè)差異基因中，根

9、據(jù)Peak Score＞2，Peak MValue＞0.7，基因啟動(dòng)子類型為HCP或ICP，基因類型包括細(xì)胞周期、損傷修復(fù)、增殖及凋亡等指標(biāo)，共選擇代表基因8個(gè)(Camk4、Fgfr3、FZD10、Gpx4、Hoxd3、Nfkb2、Prkcb、Tcfeb)，然后做MeDIP-qPCR驗(yàn)證，測(cè)定結(jié)果和芯片相同(P＜0.05)，表明芯片具有較高的可靠性。
　　5.體外實(shí)驗(yàn):姜黃素處理大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞，可抑制TGF-β1誘