依那普利聯(lián)合姜黃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化小鼠肝臟的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、目的:肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝臟在受到慢性損傷時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)分泌與降解失衡,導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)過度沉積的病理過程,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是各種致炎因子和ECM的主要分泌細(xì)胞,其激活、增殖是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 方法:選用8周齡健康雄性昆明小鼠50只,隨機(jī)分為5組:對(duì)照組、肝纖維化模型組、姜黃素治療組、依那普利治

2、療組、姜黃素聯(lián)合依那普利治療組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,除正常對(duì)照組外,各組均給予10％的CCl4橄欖油腹腔注射(5ul/g),每周2次,正常對(duì)照組給予生理鹽水腹腔注射(5ul/g),每周2次,均注射10周。開始造模2周后對(duì)照組及模型組小鼠給予生理鹽水灌胃,各治療組小鼠分別給予姜黃素(100ug/g)、依那普利(10mg/kg)、及姜黃素聯(lián)合依那普利(姜黃素100ug/g,依那普利10mg/kg)灌胃治療,每周3次,治療8周后處死。留取血清檢

3、測(cè)肝功能ALT、AST、和血清肝纖維化指標(biāo)HA;留取部分肝組織10％中性福爾馬林固定,石蠟包埋,蘇木精-伊紅(HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學(xué)改變;免疫組織化學(xué)染色法觀察肝組織NF-κB P65、IKB、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá);提取肝組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果:1小鼠一般情況:對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好,活動(dòng)自如,模型組小鼠精

4、神萎靡,動(dòng)作遲緩,體重明顯下降;各治療組小鼠的情況好于模型組。各組小鼠體重依次為:模型組(34.43±4.08g)＜姜黃素治療組(43.38±4.75g)＜依那普利治療組(43.56±2.88g)＜聯(lián)合治療組(49.75±3.62g)＜對(duì)照組(53.60±3.51g),與模型組比較,各治療組及對(duì)照組小鼠體重均有所增加且有顯著差異(P＜0.05);對(duì)照組及聯(lián)合治療組小鼠體重高于姜黃素治療組和依那普利治療組(P＜0.05),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

5、;姜黃素治療組與依那普利治療組間及對(duì)照組與聯(lián)合治療組間小鼠體重比較無顯著差異(P＞0.05)。
　　 2血清學(xué)指標(biāo):模型組小鼠血清ALT、AST、HA明顯升高,姜黃素治療組、依那普利治療組及聯(lián)合治療組ALT、AST、HA均有所升高,但均低于模型組,各組小鼠血清ALT水平依次為:模型組(155.29±21.56U/L)＞依那普利治療組(92.11±16.89U/L)＞姜黃素治療組(83.75±14.54U/L)＞聯(lián)合治療組(47.

6、50±9.17U/L)＞對(duì)照組(26.60±5.22U/L),對(duì)照組及各治療組血清ALT水平均低于模型組(P＜0.05),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;聯(lián)合治療組效果優(yōu)于依那普利及姜黃素單藥治療組(P＜0.05),結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;依那普利治療組與姜黃素治療組間血清ALT水平無顯著差異(P＞0.05)。血清AST變化情況:各組小鼠血清AST水平依次為:模型組(205.29±15.86U/L)＞依那普利治療組(123.22±10.47U/L)＞姜黃素

7、治療組(98.38±12.41U/L)＞聯(lián)合治療組(79.88±9.83U/L)＞對(duì)照組(65.20±16.41U/L),各組之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05);血清HA變化情況:各組小鼠血清HA水平依次為:模型組(1680.22±94.19ng/ml)＞依那普利治療組(869.89±110.53ng/ml)＞姜黃素治療組(608.71±120.74ng/ml)＞聯(lián)合治療組(396.13±78.17ng/ml)＞對(duì)照組(144.

8、20±37.09ng/ml),各組之間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05)。
　　 3肝組織病理學(xué)檢測(cè)
　　 3.1肉眼觀察:對(duì)照組小鼠肝臟呈紅褐色,被膜光滑,質(zhì)地柔軟;模型組小鼠肝臟呈暗紅色,顏色晦暗,表面顆粒感,質(zhì)地較硬;各治療組小鼠肝組織大體觀察明顯好于肝纖維化模型組。
　　 3.2光鏡下觀察
　　 3.2.1 HE染色:對(duì)照組小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝板走行整齊,無炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生;模型

9、組肝組織小葉結(jié)構(gòu)被破壞,可見肝細(xì)胞變性壞死,大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);各治療組小鼠肝損傷較模型組減輕,模型組與聯(lián)合治療組及對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),依那普利治療組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.2.2 Masson膠原染色:對(duì)照組小鼠肝組織內(nèi)僅在血管壁、匯管區(qū)有少量膠原纖維存在,無纖維組織增生及假小葉形成;模型組在匯管區(qū)可見大量膠原纖維組織增生,并可見假小葉形成;各治療組纖維化程度均較模型組輕,模型組

10、與聯(lián)合治療組及對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),依那普利治療組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4免疫組化染色
　　 4.1肝組織NF-κB P65蛋白表達(dá):對(duì)照組小鼠肝組織中較少表達(dá)NF-κB p65,模型組小鼠肝細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)明顯增強(qiáng),胞漿內(nèi)亦有表達(dá),各治療組NF-κB p65表達(dá)較對(duì)照組有所增加,但均少于模型組,各組水平依次為:模型組(2.20±0.10)＞依那普利治療組(1

11、.18±0.13)＞姜黃素治療組(0.95±0.07)＞聯(lián)合治療組(0.62±0.06)＞對(duì)照組(0.42±0.06),各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.2肝組織IκB蛋白表達(dá):對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞漿內(nèi)有較弱的IκB表達(dá),細(xì)胞核內(nèi)無表達(dá);在模型組及各治療組中表達(dá)均較對(duì)照組增加,其中聯(lián)合治療組陽性表達(dá)明顯增加,以胞漿表達(dá)增多為主,模型組胞漿及胞核中均有表達(dá),以胞核為主,但表達(dá)水平低于各治療組,各組水平依次為聯(lián)合治療

12、組(2.20±0.14)＞姜黃素治療組(1.35±0.12)＞依那普利治療組(1.08±0.07)＞模型組(0.94±0.13)＞對(duì)照組(0.50±0.06)各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.3肝組織ICAM-1蛋白表達(dá):對(duì)照組肝組織僅肝竇內(nèi)皮細(xì)胞有少量表達(dá),模型組除上述表達(dá)增強(qiáng)外,肝細(xì)胞漿可見ICAM-1表達(dá),陽性細(xì)胞多分布于匯管區(qū)、中央靜脈周圍,肝小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)和壞死灶,各治療組肝細(xì)胞ICAM-1陽

13、性表達(dá)均較模型組減輕,各組水平依次為:模型組(2.02±0.09)＞依那普利治療組(1.61±0.08)＞姜黃素治療組(1.11±0.14)＞聯(lián)合治療組(0.75±0.13)＞對(duì)照組(0.36±0.1),各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.4肝組織VCAM-1蛋白表達(dá):對(duì)照組肝組織內(nèi)幾乎無VCAM-1表達(dá),隨著炎癥及纖維化的發(fā)展,肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及肝細(xì)胞漿中可見陽性表達(dá)。模型組在中央靜脈、匯管區(qū)及炎癥灶周圍竇內(nèi)皮細(xì)

14、胞陽性表達(dá)增加,肝細(xì)胞漿內(nèi)彌漫性陽性表達(dá),各組水平依次為:模型組(1.66±0.11)＞依那普利治療組(1.12±0.10)＞姜黃素治療組(1.014±0.05)＞聯(lián)合治療組(0.69±0.05)＞對(duì)照組(0.26±0.08),各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5 RT-PCR檢測(cè)
　　 5.1肝組織ICAM-1 mRNA表達(dá):與對(duì)照組相比,模型組肝組織中ICAM-1 mRNA表達(dá)明顯增加,各治療組表達(dá)高

15、于對(duì)照組少于模型組,各組水平依次為:模型組(1.10±0.16)＞依那普利治療組(0.79±0.11)＞姜黃素治療組(0.69±0.13)＞聯(lián)合治療組(0.42±0.08)＞對(duì)照組(0.29±0.11),與模型組相比,對(duì)照組及各治療組表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照組及聯(lián)合治療組表達(dá)水平低于姜黃素或依那普利單藥治療組(P＜0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;對(duì)照組和聯(lián)合治療組間、姜黃素治療組和依那普利治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

16、05)。
　　 5.2肝組織VCAM-1 mRNA表達(dá):模型組、依那普利治療組、姜黃素治療組、聯(lián)合治療組、對(duì)照組水平依次為:模型組(1.39±0.21)＞依那普利治療組(0.89±0.12)＞姜黃素治療組(0.81±0.12)＞聯(lián)合治療組(0.54±0.10)＞對(duì)照組(0.28±0.10),對(duì)照組及各治療組表達(dá)水平均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);聯(lián)合治療組表達(dá)水平低于姜黃素或依那普利單藥治療組(P＜0.05),差

17、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;姜黃素治療組與依那普利治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 6肝組織纖維化程度與肝組織ICAM-1和VCAM-1蛋白的相關(guān)性分析:ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)水平與纖維化分期呈直線相關(guān)關(guān)系,纖維化程度越重,ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達(dá)水平越高。
　　 結(jié)論:
　　 1小鼠經(jīng)CCl4腹腔注射10周后可誘導(dǎo)典型的肝纖維化模型,且病理改變符合人類肝纖維化的特點(diǎn)。
　　

18、2肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與NF-κB活性增加及其下游ICAM-1、VCAM-1的高表達(dá)密切相關(guān),IκB的高表達(dá)則可以抑制肝纖維化的進(jìn)展。
　　 3依那普利及姜黃素均可改善肝功能及肝組織纖維化及炎癥壞死程度,具有抑制肝纖維化的作用。
　　 4依那普利及姜黃素均可能通過抑制NF-κB活性進(jìn)而減少其下游基因ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達(dá),減輕肝組織炎癥及肝纖維化,而發(fā)揮對(duì)肝纖維化的治療作用。
　　 5依那普利聯(lián)合