依那普利聯(lián)合姜黃素對實驗性肝纖維化小鼠肝臟的保護作用及機制.pdf

1、目的:肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝臟在受到慢性損傷時細胞外基質(extracellular matrix,ECM)分泌與降解失衡,導致ECM在肝內過度沉積的病理過程,肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)是各種致炎因子和ECM的主要分泌細胞,其激活、增殖是肝纖維化的關鍵環(huán)節(jié)。
　　 方法:選用8周齡健康雄性昆明小鼠50只,隨機分為5組:對照組、肝纖維化模型組、姜黃素治療組、依那普利治

2、療組、姜黃素聯(lián)合依那普利治療組。適應性喂養(yǎng)1周后,除正常對照組外,各組均給予10％的CCl4橄欖油腹腔注射(5ul/g),每周2次,正常對照組給予生理鹽水腹腔注射(5ul/g),每周2次,均注射10周。開始造模2周后對照組及模型組小鼠給予生理鹽水灌胃,各治療組小鼠分別給予姜黃素(100ug/g)、依那普利(10mg/kg)、及姜黃素聯(lián)合依那普利(姜黃素100ug/g,依那普利10mg/kg)灌胃治療,每周3次,治療8周后處死。留取血清檢

3、測肝功能ALT、AST、和血清肝纖維化指標HA;留取部分肝組織10％中性福爾馬林固定,石蠟包埋,蘇木精-伊紅(HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學改變;免疫組織化學染色法觀察肝組織NF-κB P65、IKB、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達;提取肝組織總RNA,逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達。
　　 結果:1小鼠一般情況:對照組小鼠精神狀態(tài)良好,活動自如,模型組小鼠精

4、神萎靡,動作遲緩,體重明顯下降;各治療組小鼠的情況好于模型組。各組小鼠體重依次為:模型組(34.43±4.08g)＜姜黃素治療組(43.38±4.75g)＜依那普利治療組(43.56±2.88g)＜聯(lián)合治療組(49.75±3.62g)＜對照組(53.60±3.51g),與模型組比較,各治療組及對照組小鼠體重均有所增加且有顯著差異(P＜0.05);對照組及聯(lián)合治療組小鼠體重高于姜黃素治療組和依那普利治療組(P＜0.05),結果有統(tǒng)計學差異

5、;姜黃素治療組與依那普利治療組間及對照組與聯(lián)合治療組間小鼠體重比較無顯著差異(P＞0.05)。
　　 2血清學指標:模型組小鼠血清ALT、AST、HA明顯升高,姜黃素治療組、依那普利治療組及聯(lián)合治療組ALT、AST、HA均有所升高,但均低于模型組,各組小鼠血清ALT水平依次為:模型組(155.29±21.56U/L)＞依那普利治療組(92.11±16.89U/L)＞姜黃素治療組(83.75±14.54U/L)＞聯(lián)合治療組(47.

6、50±9.17U/L)＞對照組(26.60±5.22U/L),對照組及各治療組血清ALT水平均低于模型組(P＜0.05),結果有統(tǒng)計學差異;聯(lián)合治療組效果優(yōu)于依那普利及姜黃素單藥治療組(P＜0.05),結果有統(tǒng)計學差異;依那普利治療組與姜黃素治療組間血清ALT水平無顯著差異(P＞0.05)。血清AST變化情況:各組小鼠血清AST水平依次為:模型組(205.29±15.86U/L)＞依那普利治療組(123.22±10.47U/L)＞姜黃素

7、治療組(98.38±12.41U/L)＞聯(lián)合治療組(79.88±9.83U/L)＞對照組(65.20±16.41U/L),各組之間比較均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05);血清HA變化情況:各組小鼠血清HA水平依次為:模型組(1680.22±94.19ng/ml)＞依那普利治療組(869.89±110.53ng/ml)＞姜黃素治療組(608.71±120.74ng/ml)＞聯(lián)合治療組(396.13±78.17ng/ml)＞對照組(144.

8、20±37.09ng/ml),各組之間比較均有統(tǒng)計學意義(P值均＜0.05)。
　　 3肝組織病理學檢測
　　 3.1肉眼觀察:對照組小鼠肝臟呈紅褐色,被膜光滑,質地柔軟;模型組小鼠肝臟呈暗紅色,顏色晦暗,表面顆粒感,質地較硬;各治療組小鼠肝組織大體觀察明顯好于肝纖維化模型組。
　　 3.2光鏡下觀察
　　 3.2.1 HE染色:對照組小鼠肝臟肝小葉結構正常,肝板走行整齊,無炎細胞浸潤及纖維組織增生;模型

9、組肝組織小葉結構被破壞,可見肝細胞變性壞死,大量炎細胞浸潤;各治療組小鼠肝損傷較模型組減輕,模型組與聯(lián)合治療組及對照組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),依那普利治療組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.2.2 Masson膠原染色:對照組小鼠肝組織內僅在血管壁、匯管區(qū)有少量膠原纖維存在,無纖維組織增生及假小葉形成;模型組在匯管區(qū)可見大量膠原纖維組織增生,并可見假小葉形成;各治療組纖維化程度均較模型組輕,模型組

10、與聯(lián)合治療組及對照組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),依那普利治療組與對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4免疫組化染色
　　 4.1肝組織NF-κB P65蛋白表達:對照組小鼠肝組織中較少表達NF-κB p65,模型組小鼠肝細胞核中NF-κB p65表達明顯增強,胞漿內亦有表達,各治療組NF-κB p65表達較對照組有所增加,但均少于模型組,各組水平依次為:模型組(2.20±0.10)＞依那普利治療組(1

11、.18±0.13)＞姜黃素治療組(0.95±0.07)＞聯(lián)合治療組(0.62±0.06)＞對照組(0.42±0.06),各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.2肝組織IκB蛋白表達:對照組小鼠肝細胞漿內有較弱的IκB表達,細胞核內無表達;在模型組及各治療組中表達均較對照組增加,其中聯(lián)合治療組陽性表達明顯增加,以胞漿表達增多為主,模型組胞漿及胞核中均有表達,以胞核為主,但表達水平低于各治療組,各組水平依次為聯(lián)合治療

12、組(2.20±0.14)＞姜黃素治療組(1.35±0.12)＞依那普利治療組(1.08±0.07)＞模型組(0.94±0.13)＞對照組(0.50±0.06)各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.3肝組織ICAM-1蛋白表達:對照組肝組織僅肝竇內皮細胞有少量表達,模型組除上述表達增強外,肝細胞漿可見ICAM-1表達,陽性細胞多分布于匯管區(qū)、中央靜脈周圍,肝小葉內炎癥細胞浸潤區(qū)和壞死灶,各治療組肝細胞ICAM-1陽

13、性表達均較模型組減輕,各組水平依次為:模型組(2.02±0.09)＞依那普利治療組(1.61±0.08)＞姜黃素治療組(1.11±0.14)＞聯(lián)合治療組(0.75±0.13)＞對照組(0.36±0.1),各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.4肝組織VCAM-1蛋白表達:對照組肝組織內幾乎無VCAM-1表達,隨著炎癥及纖維化的發(fā)展,肝竇內皮細胞及肝細胞漿中可見陽性表達。模型組在中央靜脈、匯管區(qū)及炎癥灶周圍竇內皮細

14、胞陽性表達增加,肝細胞漿內彌漫性陽性表達,各組水平依次為:模型組(1.66±0.11)＞依那普利治療組(1.12±0.10)＞姜黃素治療組(1.014±0.05)＞聯(lián)合治療組(0.69±0.05)＞對照組(0.26±0.08),各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 5 RT-PCR檢測
　　 5.1肝組織ICAM-1 mRNA表達:與對照組相比,模型組肝組織中ICAM-1 mRNA表達明顯增加,各治療組表達高

15、于對照組少于模型組,各組水平依次為:模型組(1.10±0.16)＞依那普利治療組(0.79±0.11)＞姜黃素治療組(0.69±0.13)＞聯(lián)合治療組(0.42±0.08)＞對照組(0.29±0.11),與模型組相比,對照組及各治療組表達水平均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);對照組及聯(lián)合治療組表達水平低于姜黃素或依那普利單藥治療組(P＜0.05),有統(tǒng)計學意義;對照組和聯(lián)合治療組間、姜黃素治療組和依那普利治療組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.

16、05)。
　　 5.2肝組織VCAM-1 mRNA表達:模型組、依那普利治療組、姜黃素治療組、聯(lián)合治療組、對照組水平依次為:模型組(1.39±0.21)＞依那普利治療組(0.89±0.12)＞姜黃素治療組(0.81±0.12)＞聯(lián)合治療組(0.54±0.10)＞對照組(0.28±0.10),對照組及各治療組表達水平均低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);聯(lián)合治療組表達水平低于姜黃素或依那普利單藥治療組(P＜0.05),差

17、異有統(tǒng)計學意義;姜黃素治療組與依那普利治療組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 6肝組織纖維化程度與肝組織ICAM-1和VCAM-1蛋白的相關性分析:ICAM-1、VCAM-1蛋白表達水平與纖維化分期呈直線相關關系,纖維化程度越重,ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達水平越高。
　　 結論:
　　 1小鼠經CCl4腹腔注射10周后可誘導典型的肝纖維化模型,且病理改變符合人類肝纖維化的特點。
　　

18、2肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與NF-κB活性增加及其下游ICAM-1、VCAM-1的高表達密切相關,IκB的高表達則可以抑制肝纖維化的進展。
　　 3依那普利及姜黃素均可改善肝功能及肝組織纖維化及炎癥壞死程度,具有抑制肝纖維化的作用。
　　 4依那普利及姜黃素均可能通過抑制NF-κB活性進而減少其下游基因ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達,減輕肝組織炎癥及肝纖維化,而發(fā)揮對肝纖維化的治療作用。
　　 5依那普利聯(lián)合