姜黃素防治小鼠肝纖維化效果的觀察.pdf

1、目的：肝纖維化是各種慢性肝病的共有病理基礎，目前認為肝纖維化發(fā)生的主要機制是肝臟細胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解失衡，導致ECM在肝內(nèi)過度沉積。肝星狀細胞（HSC）是位于Disse間隙的一種間質(zhì)細胞，正常情況下處于靜息狀態(tài)，活化后HSC表達α-SMA水平增高，合成包括膠原在內(nèi)的ECM，故而HSC的激活和增殖已成為肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。結締組織生長因子（CTGF）是一種細胞生長調(diào)節(jié)因子，與細胞增殖、分化的調(diào)控及組織器官纖維化的發(fā)生密切相

2、關，其在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。臨床上抑制甚或逆轉肝纖維化向前發(fā)展極為重要，但目前尚缺乏可靠有效的藥物。姜黃素（curcumin）是從姜黃屬中藥分離出的主要藥理活性成分，具有抗炎、抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用。大量研究證實，姜黃素可通過多種途徑發(fā)揮抗肝纖維化作用。本實驗通過檢測CCL4誘導的小鼠肝纖維化肝組織中CTGF的表達，以及姜黃素對肝細胞株HSC-T6增殖的影響，探討CTGF在肝纖維化發(fā)展中的作用，探討姜黃

3、素防治肝纖維化的可能機制，并為肝纖維化的治療提供新的靶點。
　　 方法：6～8周齡雌性C57BL/6J小鼠隨機分為4組，正常對照組、模型對照組、姜黃素預防組和姜黃素治療組。除正常對照組外，各組小鼠均給予四氯化碳5ul/g體重（與橄欖油以1：9混合）腹腔注射，每周2次，共8周。姜黃素預防組、姜黃素治療組小鼠分別于試驗第一周和第七周給予姜黃素50mg/kg體重，每周3次灌胃處理，正常對照組給予等劑量蒸餾水灌胃，每周3次。所有小鼠均于

4、8周后處死。小鼠斷頭取血檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT），透明質(zhì)酸（HA）水平；肝組織行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson膠原染色，觀察肝臟病理組織學炎癥和纖維化改變；免疫組織化學方法檢測CTGF-α-平滑肌收縮蛋白（α-SMA）的含量，采用北京航空航天大學真色彩病理圖像分析系統(tǒng)分析結果，每個樣本取3張切片，每張切片取5個視野進行圖像分析，分析各圖象陽性面密度（陽性細胞所占面積/視野總面積×100％）；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-P

5、CR）法檢測肝組織CTGF mRNA的表達；流式細胞技術檢測姜黃素對體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細胞（HSC-T6）細胞周期和的凋亡率的影響。
　　 結果：⑴正常組小鼠精神狀態(tài)良好，活動自如，毛發(fā)整齊有光澤，食欲好，每周體重增長正常。模型組小鼠隨著四氯化碳注射時間的延長，變得易激惹，個別具有攻擊性，毛發(fā)失去光澤，紊亂，精神萎靡，食欲下降，體重增長慢或不增。而姜黃素治療組隨著給藥天數(shù)的增加，造模時的癥狀逐漸得到改善。8周末，與正常對照組相

6、比，模型對照組、姜黃素預防組和姜黃素治療組小鼠體重明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P值均<0.05）。與模型對照組比較，姜黃素預防組和治療組小鼠體重有所增加，差異有統(tǒng)計學意義（P值均<0.05）。姜黃素預防組和姜黃素治療組小鼠體重相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。⑵實驗動物血清ALT水平，模型對照組（168.62±13.75 U/L）>姜黃素治療組（104.86±11.68 U/L）>姜黃素預防組（82.98±9.57U/L）>正常對

7、照組（47.91±8.08U/L），各組之間ALT水平的兩兩比較均有統(tǒng)計學意義，P<0.05；實驗動物血清H A水平，模型對照組（1609.95±125.91ng/ml）>姜黃素治療組（1290.26±127.59ng/ml）>姜黃素預防組（953.39±98.48ng/ml）>正常對照組（759.10±77.31ng/ml），各組之間HA水平的兩兩比較均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。⑶肝組織標本形態(tài)：正常對照組小鼠肝臟為紅褐色，明亮有光

8、澤；模型對照組小鼠肝臟大體色澤偏暗，表面欠光滑，體積較正常對照組略有減小，肝臟邊緣變鈍，質(zhì)地較實，肝臟表面可見散在黃色脂肪顆粒；姜黃素預防組和姜黃素治療組小鼠肝臟紅褐色，有光澤，體積未見明顯縮小。⑷α-SMA免疫組織化學染色：與空白陰性對照比較，以細胞和組織棕黃色染色為陽性表達。正常對照組無α-SMA陽性染色，其余實驗組組中α-SMA主要表達于匯管區(qū)血管壁中、肝纖維組織與肝實質(zhì)交界處，少量表達于肝實質(zhì)的竇周間隙，偶見于中央靜脈壁中。四組

9、α-SMA表達量：模型對照組（8.21±1.48）>姜黃素治療組（6.25±1.69）>姜黃素預防組（4.78±1.32）>正常對照組（1.51±0.95），兩兩比較，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。⑸與正常對照組（0.15±0.02）相比，模型對照組（0.42±0.02）、姜黃素預防組（0.27±0.01）、姜黃素治療組（0.34±0.01）CTGFmRNA表達明顯增加，而姜黃素預防組及治療組表達較模型對照組明顯下降，且表達量：姜黃

10、素預防組<姜黃素治療組，兩者比較，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。⑹姜黃素40μmol/L作用于體外培養(yǎng)的大鼠HSC，24 h后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變，結果顯示：姜黃素處理后，HSC細胞發(fā)生皺縮，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，凋亡細胞體積較正常細胞變小，核染色質(zhì)濃縮，沿核膜排列，細胞器也發(fā)生濃縮，并可見凋亡小體。
　　 結論：①應用10％CC14橄欖油溶液腹腔注射8周，可成功建立符合血清生化學和病理特征的小鼠肝纖維化模型。②結締組