基于識別Fn14的姜黃素脂質(zhì)體靶向抗肝纖維化的初步研究.pdf

1、背景：肝纖維化是由長期肝損傷引起，導致細胞外基質(zhì)過度沉積的機體創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)。肝星狀細胞在肝纖維化的進程中扮演了重要角色，而抑制其增殖活化過程則成為肝纖維化治療的有效策略。全球范圍來看，肝纖維化和肝硬化的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，但目前臨床卻沒有切實有效的肝纖維化治療藥物或手段，對患者及醫(yī)生造成了極大的困擾。因此我們亟需研發(fā)安全有效、具有針對性的抗纖維化制劑，解決臨床用藥難、病人病情無法得到有效控制的問題。
　　目的：開發(fā)安全有效

2、并能靶向到達病灶部位的抗纖維化制劑，采用主動靶向遞藥策略治療肝纖維化，其主要內(nèi)容包括多肽導向分子修飾靶向脂質(zhì)體的制備與表征、多肽導向分子修飾靶向脂質(zhì)體體外靶向性及藥效評價以及多肽導向分子修飾靶向脂質(zhì)體體內(nèi)靶向性及藥效評價三個方面。
　　方法與結(jié)果：使用SPR和分子對接技術(shù)考察功能多肽與Fn14胞外區(qū)蛋白的結(jié)合能力和鍵合方式，實驗結(jié)果表明功能多肽（序列為 DCDHDPDR DEDVDDDVDEDLDYDSDTDVDFDGDH）對Fn

3、14胞外區(qū)蛋白有較強的親和力。利用 MAL-PEG3400-DSPE中活化基團馬來酰亞胺與D-FNB肽的活性巰基反應(yīng)，合成得到靶向材料D-FNB-PEG3400-DSPE，采用薄層色譜法（TLC）監(jiān)測反應(yīng)進程，然后對水透析純化凍干。結(jié)果表明該法能夠成功合成脂質(zhì)體靶向材料D-FNB-PEG3400-DSPE。其后將傳統(tǒng)多酚類抗炎藥物姜黃素（CUR）作為藥物模型，采用薄膜水化法制備 D-FNB-LIP/CUR，所得脂質(zhì)體粒徑較均一（144.

4、21±1.14 nm），分散性良好，透射電鏡（TEM）下脂質(zhì)體形態(tài)圓整，脂質(zhì)體包封率高達94.86±2.14％，體外釋放結(jié)果表明，脂質(zhì)體上是否修飾 D-FNB肽對CUR的釋放情況沒有影響。使用細胞免疫熒光定性考察兩種細胞上的受體表達情況。結(jié)果表明，活化型肝星狀細胞上高表達α-SMA和Fn14受體，而正常肝細胞則低表達或不表達α-SMA和Fn14受體。說明活化型肝星狀細胞上特異性高表達Fn14受體。而后采用倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀對D-

5、FNB-LIP的體外細胞攝取進行定性及定量評價，熒光顯微鏡觀察顯示， D-FNB-LIP/Coumarin-6在肝星狀細胞上的熒光量明顯強于mPEG-LIP/Coumarin-6，但在正常肝細胞上的熒光攝取差別不大。同時經(jīng)流式定量攝取表明，D-FNB-LIP/Coumarin-6相較于 mPEG-LIP/Coumarin-6在肝星狀細胞的熒光攝取量上提高了2.54倍，而在正常肝細胞上無明顯差異。其次，通過靶向脂質(zhì)體競爭性抑制實驗再次證實

6、D-FNB肽能夠特異性識別Fn14過表達細胞。綜上實驗表明，D-FNB-LIP具有良好的體外靶向性。其后通過細胞藥效MTT實驗，評價D-FNB肽修飾脂質(zhì)體的體外細胞毒性，結(jié)果表明 D-FNB-LIP/CUR（ IC50=7.3μg/mL）相較于mPEG-LIP/CUR（IC50=18.6μg/mL）細胞毒性更強，能夠有效抑制肝星狀細胞的增殖，而對正常肝細胞無明顯毒性。最后通過TUNEL細胞凋亡檢測和Western Blot探究姜黃素制劑

7、對活化型肝星狀細胞的作用機制。細胞凋亡檢測結(jié)果表明， D-FNB-LIP/CUR能夠誘導更多活化型肝星狀細胞啟動凋亡程序，進入凋亡狀態(tài)。同時Western Blot結(jié)果顯示D-FNB-LIP/CUR可在一定程度上較多抑制活化型肝星狀細胞上α-SMA的表達。初步顯示姜黃素制劑在體外可通過導致細胞凋亡和抑制α-SMA表達、減少細胞外基質(zhì)的合成分泌的方式發(fā)揮抗纖維化藥效，以達到緩解肝纖維化的作用。使用腹腔注射四氯化碳的方法建立小鼠肝纖維化模型

8、，并采用肝功生化指標、外觀和HE、天狼猩紅染色評價不同周期造模小鼠的纖維化程度。其中血清生化指標測定結(jié)果顯示，造模八周小鼠的AST、ALT指標遠高于正常小鼠，提示肝功能異常。另外通過解剖造模小鼠肝臟發(fā)現(xiàn)，正常組肝臟質(zhì)地柔軟、表面光滑、富有光澤，而模型組肝臟質(zhì)地變硬、沒有光澤、顆粒感嚴重，說明肝臟部位發(fā)生病變。而后HE染色結(jié)果顯示，造模八周小鼠的炎性細胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中央靜脈橋接壞死并形成假小葉。天狼猩紅染色則將大量沉積于纖維隔膜

9、和匯管區(qū)的膠原染成紅色，表現(xiàn)為紅色網(wǎng)狀纖維。綜上實驗表明成功建立肝纖維化動物模型。體內(nèi)實驗則首先使用熒光成像和體內(nèi)組織分布評價D-FNB-LIP/DiR的體內(nèi)靶向性，熒光成像實驗證明，D-FNB-LIP/DiR相較于 mPEG-LIP/DiR能顯著提高制劑在造模小鼠肝臟的分布，而在正常小鼠體內(nèi)分布區(qū)別相對較少，同時體內(nèi)組織分布結(jié)果表明， D-FNB-LIP/CUR相較于mPEG-LIP/CUR在造模小鼠肝臟分布更多，綜上提示其在造模小鼠

10、體內(nèi)靶向性較好。其次通過組織制劑共定位實驗考察了D-FNB肽修飾脂質(zhì)體的體內(nèi)分布，實驗結(jié)果表明D-FNB-LIP/Coumarin-6肝纖維化發(fā)生部位的聚集相較于mPEG-LIP/Coumarin-6更為密集，進一步揭示了D-FNB-LIP/Coumarin-6能夠有針對性的將藥物遞送到病灶部位。此后將肝纖維化小鼠分為D-FNB-LIP/CUR組、mPEG-LIP/CUR組和生理鹽水組，利用組織免疫熒光、HE染色、天狼猩紅染色并測定肝功

11、生化指標、對各組藥效進行評判。肝臟免疫熒光結(jié)果顯示， FNB-LIP/CUR治療組切片的α-SMA、Fn14表達量相較于mPEG-LIP/CUR組和生理鹽水組明顯降低。切片染色結(jié)果表明D-FNB-LIP/CUR組的肝纖維化部位相較于另外兩組恢復(fù)較好，且AST、ALT指標有所降低，指示炎癥減輕。而mPEG-LIP/CUR組和生理鹽水組AST、ALT水平依舊很高，炎癥嚴重。以上結(jié)果表明D-FNB-LIP/CUR相較于而mPEG-LIP/CU

12、R和生理鹽水組可明顯緩解肝臟纖維化程度，對肝纖維化具有一定的治療效果。
　　結(jié)論：設(shè)計并制備了導向分子（D-FNB肽）介導的靶向遞藥系統(tǒng)，借助主動靶向遞藥策略，有效提高了藥物在病灶部位的蓄積，并通過體內(nèi)外藥效學研究，證實該靶向制劑所具有的治療效果。以達到抑制活化型肝星狀細胞的增殖，減輕炎癥從而減少細胞外基質(zhì)沉積，改善肝纖維化的目的，本課題成功制備多肽導向分子修飾的包載姜黃素藥物的主動靶向遞藥系統(tǒng)，為肝纖維化的研究治療提供了有益的思