VitA偶聯(lián)脂質體包裹MMP-2 siRNA靶向預防肝纖維化的體外研究.pdf

1、研究目的：制備VitA偶聯(lián)陽離子脂質體，并以其為基質金屬蛋白酶-2小干擾RNA(MMP-2siRNA)的載體，對肝星狀細胞(HSC-T6)進行靶向干擾，檢測MMP-2靶向干擾對HSC-T6細胞活化及Ⅰ型膠原分泌情況的影響，體外評估MMP-2靶向干擾對肝纖維化逆轉的影響。
　　研究方法：
　?、購腉eneBank中檢索大鼠MMP-2基因全長mRNA序列，設計3條MMP-2 siRNA靶序列(命名為A、B、C)和1條陰性對照序列

2、。轉染36h后，RT-PCR檢測MMP-2基因表達量，確定特異性siRNA的有效性。②以DCC-DMAP法合成VitA-腦磷脂活性脂，經(jīng)傅里葉紅外光譜分析對其表征。③以薄膜分散-超聲振蕩法制備陽離子脂質體，并進行VitA修飾。采用透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)、激光粒度分析儀對VitA修飾前后陽離子脂質體外形、粒徑、分散度、zeta電位進行分析。瓊脂糖凝膠電泳檢測陽離子脂質體與siR

3、NA的結合情況。陽離子脂質體包裹FAM-siRNA體外轉染HSC-T6，6h后熒光顯微鏡下觀察，檢測其轉染能力。MTT實驗評價其體外細胞毒性。④VitA偶聯(lián)脂質體包裹MMP-2 siRNA轉染HSC-T6，做無血清培養(yǎng)，12h、24h、36h、48h、72h后分別收集細胞上清并提取細胞總RNA，RT-PCR和明膠酶譜檢測靶向干擾后HSC-T6細胞MMP-2 mRNA及酶活性變化情況。⑤VitA聯(lián)脂質體包裹MMP-2siRNA轉染HSCs

4、48h后，冷丙酮固定，觀察其形態(tài)學變化及細胞凋亡情況。免疫組織化學染色觀察MMP-2靶向干擾對HSC-T6α-SMA及Ⅰ型膠原表達的影響。
　　研究結果：①轉染36h后，收集細胞提取RNA，RT-PCR結果顯示3條siRNA的干擾效率相當，分別為61.84％、52.87％、58.76％，在后續(xù)試驗中，均以siRNA-A介導HSC-T6細胞MMP-2基因沉默。②傅里葉紅外光譜分析可見VitA苯環(huán)及VitA和腦磷脂(phosphati

5、dylethanolamine，PE)脫水縮合后酰胺鍵的特征峰，驗證了VitA與PE形成VitA-PE活性脂。③VitA修飾前后陽離子脂質體近似球形，大多呈單室，分散性良好。修飾前粒徑為148.2±0.3 nm，zeta電位為41.67±0.52mV，修飾后平均粒徑為227.3±4.1nm，zeta電位為44.67±0.93mV。④MTT結果顯示，VitA修飾前后陽離子脂質體轉染siRNA對HSC-T6細胞毒性低。陽離子脂質體具有良好的

6、siRNA結合能力，可將外源siRNA傳遞到細胞內，轉染FAM-siRNA6h后細胞內即可出現(xiàn)綠色熒光，且VitA修飾后轉染效率高于修飾前。⑤siRNA轉染不同時間后，明膠酶譜及RT-PCR結果顯示干擾48h后MMP-2基因表達水平及酶活性降到最低。轉染48h后，細胞體積變小，有絲分裂速率變慢。Hoechst凋亡染色顯示，MMP-2 siRNA靶向干擾并不促進HSC-T6細胞凋亡。⑥免疫細胞化學染色顯示MMP-2 siRNA靶向干擾后，

7、HSC-T6表達α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白水平顯著降低。
　　結論：①應用薄膜分散-超聲振蕩法成功制備了陽離子脂質體及VitA偶聯(lián)脂質體。②VitA偶聯(lián)脂質體對HSC-T6細胞毒性低，體外轉染HSCs效率高，為后續(xù)的RNA靶向干擾提供了一個有效的載體。③合成的MMP-2 siRNA可有效介導HSC-T6細胞MMP-2基因沉默，為后面進一步進行體外肝纖維化治療提供了實驗依據(jù)。④體外干擾MMP-2表達，可降低HSCs增殖速率及活化，并減