6-磷酸甘露糖受體靶向肝星狀細胞脂質體的研究.pdf

1、近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細胞膜上存在6-磷酸甘露糖／胰島素樣生長因子Ⅱ受體（M6P/IGFⅡ），該受體能與含有甘露糖糖基的復合物結合。肝纖維化時，肝星狀細胞的膜上的M6P/IGFⅡ將會增多，是正常水平的3-4倍，另外膽管結扎和CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中，血清中的M6P/IGFⅡ受體水平也增高了3倍。因此，針對肝纖維化后，肝星狀細胞膜上的M6P/IGFⅡ受體表達上調，可將6-磷酸甘露糖（M6P）作為配體,設計復合物,靶向肝星狀細胞。脂

2、質體是一種生物相容性好的載藥系統(tǒng)，便于攜帶藥物或者診斷試劑。因此可以將M6P配體連接到脂質體上，制備肝靶向的脂質體。
　　目前認為肝纖維化是一個可以逆轉的動態(tài)變化過程，故早期診斷對肝纖維化治療有著重要的意義。核磁共振成像技術（MRI）作為一種無創(chuàng)，可靠和具有良好可重復性的手段來監(jiān)測和評價慢性肝纖維化的進展，已經(jīng)顯示出很大的潛力。本文利用脂質體作為生物相容的給藥系統(tǒng)，嘗試將6-磷酸甘露糖作為靶向基團，包封MRI造影劑Gd-DTPA-

3、SA，制備6-磷酸甘露糖受體靶向的磁共振成像功能脂質體。
　　1.TPGS-6-磷酸甘露糖（TPGS-M6P）的合成
　　以D-甘露糖為原料，經(jīng)乙酸酐乙?；晌逖跻阴?D-吡喃甘露糖，再與對硝基苯酚反應生成對硝基苯酚-四氧乙酰-α-D-吡喃甘露糖，再甲醇解生成對硝基苯酚-α-D-吡喃甘露糖的制備，再與三氯氧磷反應生成6-磷酸-對硝基苯酚-α-D-吡喃甘露糖，最后經(jīng)氫氣還原生成6-磷酸-對氨基苯酚-α-D-吡喃甘露糖。以TP

4、GS為原料，與丁二酸酐反應生成TPGS-SA，再與6-磷酸-對氨基苯酚-α-D-吡喃甘露糖反應，制備得TPGS-M6P。反應中各產(chǎn)物經(jīng)過1HNMR或MS確證。
　　2.Gd-DTPA-SA和Gd-DTPA-TPGS的合成以DTPA為原料，先經(jīng)乙酸酐脫水生成DTPA環(huán)酸酐，再經(jīng)水解生成DTPA單環(huán)酸酐，分別與十八胺和TPGS-NH2反應生成DTPA-SA和DTPA-TPGS，最后再螯合Gd3+，得到Gd-DTPA-SA和Gd-DTP

5、A-TPGS。產(chǎn)物經(jīng)過1HNMR，質譜，紅外圖譜的確證，并通過ICP-AES測得最終產(chǎn)物中的Gd的含量，其中Gd-DTPA-SA含Gd量為16.77％，與理論值19.6％較接近；Gd-DTPA-TPGS含Gd量為4.84％，理論值為7.18％。最終我們采用Gd-DTPA-SA制備脂質體。
　　3.6-磷酸甘露糖靶向磁共振脂質體的制備及表征
　　通過薄膜分散法制備脂質體，用Gd-DTPA-SA、TPGS-M6P、HSPC、Ch

6、olesterol成膜，PBS為水化液。本文考察了Gd-DTPA-SA的投料量，認為其含量占總脂質摩爾量的25％時，脂質體最穩(wěn)定。制備的脂質體通過激光動態(tài)光散射技術考察其粒徑，測得粒徑為125nm-150nm，4℃放置三個月后，脂質未發(fā)生不沉降，粒徑也沒有發(fā)生變化。采用ICP-AES測脂質體含Gd的量，計算得出Gd的包封率較高。
　　4.6-磷酸甘露糖靶向熒光脂質體的制備及熒光法考察體外細胞對脂質體的攝取。
　　通過薄膜分散

7、法制備脂質體，用TPGS-M6P、HSPC、Cholesterol成膜，熒光材料Calcein溶液為水化液。采用熒光分光光度計考察脂質體的熒光光譜特性，發(fā)現(xiàn)脂質材料并未導致Calcein發(fā)射光譜的改變。由于Calcein在一定濃度范圍時，其濃度與紫外吸收強度呈線性關系，可計算Calcein的包封率。
　　將HSC-T6細胞與終濃度為47.5μM的Calcein-L、M6P-Calcein-L及M6P-Calcein-L+M6P共培

8、養(yǎng)2h后洗去藥液，細胞在PBS中，使用熒光倒置顯微鏡觀察。HSC-T6細胞與3種脂質體共培養(yǎng)后都沒有出現(xiàn)熒光?？赡苁怯捎贛6P受體在識別配體時，不僅需要糖基的存在，還需要有蛋白的參與。對此我們考慮以M6P-HSA為配體修飾脂質體。
　　5.M6P-HSA的制備及其靶向性的驗證
　　將6-磷酸-對氨基苯酚-α-D-吡喃甘露糖與CSCl2反應生成異硫氰酸酯，再與HSA反應生成M6P-HSA。為驗證其靶向性采用熒光材料FITC標記

9、。將HSC-T6細胞與M6P-HSA-FITC、HSA-FITC及M6P-HSA-FITC+M6P共培養(yǎng)2h后洗去藥液，細胞在PBS中，使用熒光倒置顯微鏡觀察。HSC-T6細胞與含M6P配體的蛋白溶液共培養(yǎng)后可以觀察到明亮的綠色熒光，而沒有偶聯(lián)M6P配體的蛋白溶液幾乎沒有熒光。當在M6P-HSA-FITC中加入游離M6P后，可以看到細胞內的綠色熒光明顯減弱。
　　用M6P直接修飾的脂質體對HSC-T6細胞無靶向性。可能是由于M6P