6-磷酸甘露糖受體靶向肝星狀細(xì)胞脂質(zhì)體的研究.pdf

1、近年來研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞膜上存在6-磷酸甘露糖／胰島素樣生長因子Ⅱ受體（M6P/IGFⅡ），該受體能與含有甘露糖糖基的復(fù)合物結(jié)合。肝纖維化時，肝星狀細(xì)胞的膜上的M6P/IGFⅡ?qū)龆?，是正常水平?-4倍，另外膽管結(jié)扎和CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，血清中的M6P/IGFⅡ受體水平也增高了3倍。因此，針對肝纖維化后，肝星狀細(xì)胞膜上的M6P/IGFⅡ受體表達(dá)上調(diào)，可將6-磷酸甘露糖（M6P）作為配體,設(shè)計(jì)復(fù)合物,靶向肝星狀細(xì)胞。脂

2、質(zhì)體是一種生物相容性好的載藥系統(tǒng)，便于攜帶藥物或者診斷試劑。因此可以將M6P配體連接到脂質(zhì)體上，制備肝靶向的脂質(zhì)體。
　　目前認(rèn)為肝纖維化是一個可以逆轉(zhuǎn)的動態(tài)變化過程，故早期診斷對肝纖維化治療有著重要的意義。核磁共振成像技術(shù)（MRI）作為一種無創(chuàng)，可靠和具有良好可重復(fù)性的手段來監(jiān)測和評價慢性肝纖維化的進(jìn)展，已經(jīng)顯示出很大的潛力。本文利用脂質(zhì)體作為生物相容的給藥系統(tǒng)，嘗試將6-磷酸甘露糖作為靶向基團(tuán)，包封MRI造影劑Gd-DTPA-

3、SA，制備6-磷酸甘露糖受體靶向的磁共振成像功能脂質(zhì)體。
　　1.TPGS-6-磷酸甘露糖（TPGS-M6P）的合成
　　以D-甘露糖為原料，經(jīng)乙酸酐乙?；晌逖跻阴?D-吡喃甘露糖，再與對硝基苯酚反應(yīng)生成對硝基苯酚-四氧乙酰-α-D-吡喃甘露糖，再甲醇解生成對硝基苯酚-α-D-吡喃甘露糖的制備，再與三氯氧磷反應(yīng)生成6-磷酸-對硝基苯酚-α-D-吡喃甘露糖，最后經(jīng)氫氣還原生成6-磷酸-對氨基苯酚-α-D-吡喃甘露糖。以TP

4、GS為原料，與丁二酸酐反應(yīng)生成TPGS-SA，再與6-磷酸-對氨基苯酚-α-D-吡喃甘露糖反應(yīng)，制備得TPGS-M6P。反應(yīng)中各產(chǎn)物經(jīng)過1HNMR或MS確證。
　　2.Gd-DTPA-SA和Gd-DTPA-TPGS的合成以DTPA為原料，先經(jīng)乙酸酐脫水生成DTPA環(huán)酸酐，再經(jīng)水解生成DTPA單環(huán)酸酐，分別與十八胺和TPGS-NH2反應(yīng)生成DTPA-SA和DTPA-TPGS，最后再螯合Gd3+，得到Gd-DTPA-SA和Gd-DTP

5、A-TPGS。產(chǎn)物經(jīng)過1HNMR，質(zhì)譜，紅外圖譜的確證，并通過ICP-AES測得最終產(chǎn)物中的Gd的含量，其中Gd-DTPA-SA含Gd量為16.77％，與理論值19.6％較接近；Gd-DTPA-TPGS含Gd量為4.84％，理論值為7.18％。最終我們采用Gd-DTPA-SA制備脂質(zhì)體。
　　3.6-磷酸甘露糖靶向磁共振脂質(zhì)體的制備及表征
　　通過薄膜分散法制備脂質(zhì)體，用Gd-DTPA-SA、TPGS-M6P、HSPC、Ch

6、olesterol成膜，PBS為水化液。本文考察了Gd-DTPA-SA的投料量，認(rèn)為其含量占總脂質(zhì)摩爾量的25％時，脂質(zhì)體最穩(wěn)定。制備的脂質(zhì)體通過激光動態(tài)光散射技術(shù)考察其粒徑，測得粒徑為125nm-150nm，4℃放置三個月后，脂質(zhì)未發(fā)生不沉降，粒徑也沒有發(fā)生變化。采用ICP-AES測脂質(zhì)體含Gd的量，計(jì)算得出Gd的包封率較高。
　　4.6-磷酸甘露糖靶向熒光脂質(zhì)體的制備及熒光法考察體外細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取。
　　通過薄膜分散

7、法制備脂質(zhì)體，用TPGS-M6P、HSPC、Cholesterol成膜，熒光材料Calcein溶液為水化液。采用熒光分光光度計(jì)考察脂質(zhì)體的熒光光譜特性，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)材料并未導(dǎo)致Calcein發(fā)射光譜的改變。由于Calcein在一定濃度范圍時，其濃度與紫外吸收強(qiáng)度呈線性關(guān)系，可計(jì)算Calcein的包封率。
　　將HSC-T6細(xì)胞與終濃度為47.5μM的Calcein-L、M6P-Calcein-L及M6P-Calcein-L+M6P共培

8、養(yǎng)2h后洗去藥液，細(xì)胞在PBS中，使用熒光倒置顯微鏡觀察。HSC-T6細(xì)胞與3種脂質(zhì)體共培養(yǎng)后都沒有出現(xiàn)熒光?？赡苁怯捎贛6P受體在識別配體時，不僅需要糖基的存在，還需要有蛋白的參與。對此我們考慮以M6P-HSA為配體修飾脂質(zhì)體。
　　5.M6P-HSA的制備及其靶向性的驗(yàn)證
　　將6-磷酸-對氨基苯酚-α-D-吡喃甘露糖與CSCl2反應(yīng)生成異硫氰酸酯，再與HSA反應(yīng)生成M6P-HSA。為驗(yàn)證其靶向性采用熒光材料FITC標(biāo)記

9、。將HSC-T6細(xì)胞與M6P-HSA-FITC、HSA-FITC及M6P-HSA-FITC+M6P共培養(yǎng)2h后洗去藥液，細(xì)胞在PBS中，使用熒光倒置顯微鏡觀察。HSC-T6細(xì)胞與含M6P配體的蛋白溶液共培養(yǎng)后可以觀察到明亮的綠色熒光，而沒有偶聯(lián)M6P配體的蛋白溶液幾乎沒有熒光。當(dāng)在M6P-HSA-FITC中加入游離M6P后，可以看到細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光明顯減弱。
　　用M6P直接修飾的脂質(zhì)體對HSC-T6細(xì)胞無靶向性?？赡苁怯捎贛6P