甘露糖-6-磷酸受體在惡性腫瘤免疫治療聯(lián)合化療中的作用.pdf

1、研究目的：
　　1.通過(guò)構(gòu)建不同腫瘤動(dòng)物模型，驗(yàn)證免疫治療聯(lián)合化療的增效作用。通過(guò)體外觀察化療藥物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞甘露糖-6-磷酸受體(M6PR)的影響以及相應(yīng)小鼠腫瘤模型體內(nèi)腫瘤細(xì)胞M6PR的表達(dá)變化，探討化療對(duì)腫瘤細(xì)胞M6PR的作用。構(gòu)建表達(dá)熒光素酶的野生型(H2Kb+/+)B16F10細(xì)胞(B16-Luc)及B16F10 H2Kb-/-細(xì)胞(B16-H2Kb-)。用control shRNA或是M6PR shRNA轉(zhuǎn)染B16-

2、H2Kb-細(xì)胞，分別建立其腫瘤小鼠模型并給與不同治療方法，體內(nèi)驗(yàn)證M6PR在免疫治療聯(lián)合化療中的作用。
　　2.觀察體內(nèi)、外化療后不同腫瘤細(xì)胞M6PR mRNA及其蛋白表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)M6PR主要配體IGF-Ⅱ水平的變化。體外觀察化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬現(xiàn)象的影響。通過(guò)上調(diào)以及阻斷細(xì)胞自噬，觀察化療對(duì)M6PR在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布情況，探討IGF-Ⅱ及自噬在免疫治療聯(lián)合化療中的作用。
　　研究方法：
　　1.應(yīng)用

3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)B16F10惡性黑色素瘤、4T1乳腺癌以及人多發(fā)性骨髓瘤U266腫瘤細(xì)胞系，經(jīng)化療后腫瘤細(xì)胞表面MPR的表達(dá)狀況。分別建立上述腫瘤小鼠模型，應(yīng)用免疫組化方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)化療后腫瘤組織中M6PR的表達(dá)水平。構(gòu)建表達(dá)熒光素酶的野生型(H2Kb+/+)B16F10細(xì)胞(B16-Luc)及B16F10H2Kb-/-細(xì)胞(B16-H2Kb-)。用control shRNA或是M6PR shRNA轉(zhuǎn)染B16-H2Kb-細(xì)胞，分別建立其腫瘤

4、小鼠模型，分別給與不同治療方案，采用直接測(cè)量腫瘤大小以及活體成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展。
　　2.采用Real-time PCR和Western blotting方法檢測(cè)體內(nèi)、外經(jīng)TAX、DOX化療后B16F10、4T1、U266腫瘤細(xì)胞M6PR mRNA以及M6PR總蛋白和膜蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用免疫組化和Western blotting方法檢測(cè)上述腫瘤細(xì)胞內(nèi)M6PR主要配體IGF-Ⅱ水平的變化，探索化療上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面M6PR的潛在

5、機(jī)制。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬現(xiàn)象的影響。通過(guò)自噬抑制劑3-MA或atg5 siRNA下調(diào)自噬以及通過(guò)自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin上調(diào)自噬，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡觀察化療對(duì)M6PR在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布情況。
　　結(jié)果：
　　1.免疫治療聯(lián)合化療的抗腫瘤效應(yīng)在MC38結(jié)腸癌小鼠模型中，與無(wú)治療模型對(duì)照組相比，單一p53 DC疫苗免疫治療延緩了腫瘤的進(jìn)展(P<0.05)，單一TAX化療也延緩了腫瘤的生長(zhǎng)

6、，但是治療一經(jīng)停止腫瘤迅速進(jìn)展。與單一治療相比，免疫治療聯(lián)合化療顯著的抑制了腫瘤的生長(zhǎng)(P<0.05)。在TUBO乳腺癌小鼠模型中，與無(wú)治療模型對(duì)照組相比，單一TAX化療沒(méi)有顯著的抗腫瘤作用(P>0.05)，單一Neu DC疫苗有輕微延緩腫瘤生長(zhǎng)的作用(P>0.05)。與單一治療相比，DC疫苗聯(lián)合TAX治療產(chǎn)生了顯著的抗腫瘤效果(P<0.05)。在EG-7淋巴瘤小鼠模型中，與無(wú)治療模型對(duì)照組相比，單一過(guò)繼性T細(xì)胞免疫治療或是TAX化療均

7、導(dǎo)致腫瘤縮小(P<0.05)。與單一治療相比，聯(lián)合治療的抗腫瘤效應(yīng)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　2.化療對(duì)腫瘤細(xì)胞表面M6PR的影響(1)小鼠B16F10惡性黑色素瘤、4T1乳腺癌以及人多發(fā)性骨髓瘤8226、929、U266多種腫瘤細(xì)胞體外經(jīng)化療后細(xì)胞表面M6PR均上調(diào)性表達(dá)(P<0.05)。上述腫瘤細(xì)胞經(jīng)化療后攝取顆粒酶B也顯著增加(P<0.05)。在B16F10惡性黑色素瘤、4T1乳腺癌小鼠模型中，TAX給藥48小時(shí)后，免疫

8、組化顯示腫瘤組織M6PR表達(dá)顯著性上調(diào)(P<0.05)。在給藥后72小時(shí)，M6PR仍保持較高狀態(tài)，在給藥后5天其恢復(fù)到治療前水平。在U266人多發(fā)性骨髓瘤裸鼠模型中，經(jīng)DOX治療后M6PR發(fā)生同樣的變化。
　　(2)在B16F10荷瘤小鼠，與無(wú)治療對(duì)照相比，單一Pme1-1 CTLs或是TAX顯著的抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，但是停止治療后一周腫瘤繼續(xù)增長(zhǎng)。TAX聯(lián)合T細(xì)胞治療抗腫瘤效應(yīng)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。T細(xì)胞輸入2天之后給與TAX

9、出現(xiàn)上述增強(qiáng)效應(yīng)；而T細(xì)胞輸入5天之前給與TAX，未觀察到增強(qiáng)效應(yīng)。
　　3.M6PR在化療聯(lián)合免疫治療的抗腫瘤效應(yīng)中的作用(1)在轉(zhuǎn)染了control shRNA的B16F10荷瘤小鼠中，與單一治療相比，TAX聯(lián)合Pme1-1 CTL治療抗腫瘤效應(yīng)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。在轉(zhuǎn)染了M6PR shRNA的荷瘤小鼠中，聯(lián)合治療未顯示出增強(qiáng)作用(P>0.05)。
　　(2)在B16F10 M6PR shRNA Kb-荷瘤小鼠中，

10、與未治療對(duì)照相比，單一Trp2180-188CTLs未顯示抗腫瘤活性(P>0.05)。與單一TAX化療相比，聯(lián)合治療未顯示出增強(qiáng)作用(P>0.05)。在B16F10 control shRNAKb-荷瘤小鼠中，聯(lián)合治療也未顯示出增強(qiáng)作用(P>0.05)。
　　(3)在B16F10-Luc(左側(cè)肋腹)、control shRNA Kb-(右側(cè)肋腹)雙側(cè)腫瘤小鼠模型中，針對(duì)B16F10-Luc腫瘤，聯(lián)合治療比單一免疫治療或化療顯示出增

11、強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)(P<0.05)；針對(duì)control shRNA Kb-腫瘤，聯(lián)合治療未顯示出增強(qiáng)作用(P>0.05)。在B16-Luc與control shRNA Kb-混合腫瘤模型中，與單一治療相比，聯(lián)合治療導(dǎo)致腫瘤總體積顯著縮小(P<0.05)。應(yīng)用活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)腫瘤組織中的B16F10-Luc細(xì)胞，聯(lián)合治療比單一免疫治療或化療顯示出增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)(P<0.05)。在B16-Luc與M6PR shRNA Kb-混合腫瘤模型中，與

12、單一治療相比，聯(lián)合治療未導(dǎo)致腫瘤總體積縮小(P>0.05)。應(yīng)用活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)腫瘤組織中的B16F10-Luc細(xì)胞，聯(lián)合治療比單一免疫治療或化療顯示出增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)(P<0.05)。
　　4.化療對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)。M6PR合成、講解以及再分布的影響(1)Real-time PCR結(jié)果顯示，在M6PR mRNA表達(dá)水平上，化療藥物對(duì)B16F10、4T1和EL-4腫瘤細(xì)胞沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)顯示，B16F10

13、或是4T1腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)TAX處理后，細(xì)胞表面上的M6PR被上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)M6PR總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生變化(P>0.05)。Western blotting結(jié)果顯示，用TAX處理B16F10細(xì)胞或是用DOX處理EL-4、U266細(xì)胞后，M6PR總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)，M6PR膜蛋白水平顯著增加(P<0.05)。(2)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，在U266腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療前M6PR集中在細(xì)胞漿內(nèi)，而化療后

14、其主要定位于細(xì)胞膜；在多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓切片中，治療前只有20％的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)M6PR在細(xì)胞膜上的聚集現(xiàn)象，化療后3天該比例增至50％以上(P<0.05)。
　　5.自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)M6PR再分布的影響(1)流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，經(jīng)TAX預(yù)處理的B16F10細(xì)胞體外與重組IGF-Ⅱ共同孵育，細(xì)胞表面M6PR上調(diào)表達(dá)的能力缺失，細(xì)胞攝取顆粒酶B的能力也明顯下降(P<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示，化療藥物體外

15、對(duì)4T1、EL4、B16F10三種腫瘤細(xì)胞內(nèi)IGF-Ⅱ表達(dá)水平?jīng)]有顯著作用(P>0.05)；4T1和B16F10荷瘤小鼠經(jīng)TAX體內(nèi)處理后，腫瘤組織中IGF-Ⅱ水平顯著增加(P<0.05)。(2)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，應(yīng)用TAX、CIS、DOX處理腫瘤細(xì)胞后，自噬被迅速誘導(dǎo)。應(yīng)用3-MA抑制自噬，DOX原先誘導(dǎo)的U266細(xì)胞表面M6PR的上調(diào)表達(dá)能力明顯下降(P<0.05)；經(jīng)過(guò)TAX處理后的B16F10細(xì)胞也出現(xiàn)此現(xiàn)象。應(yīng)用atg

16、5 siRNA轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞下調(diào)自噬，TAX原先誘導(dǎo)的細(xì)胞膜M6PR的上調(diào)性表達(dá)現(xiàn)象顯著下降(P<0.05)。應(yīng)用Rapamycin誘導(dǎo)自噬，腫瘤細(xì)胞表面的M6PR明顯增加(P<0.05)。用LC3-GFP轉(zhuǎn)染B16F10腫瘤細(xì)胞，未經(jīng)化療處理的細(xì)胞沒(méi)有觀察到M6PR和LC3的共定位；細(xì)胞經(jīng)TAX處理之后，更容易觀察到自噬小體和M6PR的共定位現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　化療可以增強(qiáng)CTL免疫治療的效果，而該效應(yīng)與M6PR