調控FOXA2表達影響肝纖維化進程的機制研究.pdf

1、目的：
　　肝纖維化(hepatic fibrosis)是肝硬化的早期階段，是細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在肝臟中病理性沉積的結果。各種慢性肝損傷，包括肝炎病毒感染，長期酒精過量攝入，化學毒素攝入（黃曲霉素B1）、代謝性或自身免疫反應等，均會引起肝纖維。肝纖維化進一步發(fā)展可引起肝硬化，部分患者可導致肝癌，阻斷肝纖維化將有效逆轉該進程，阻斷其進一步發(fā)展。但肝纖維的發(fā)病機制尚不明確，臨床方面缺乏公認有

2、效的防治手段。
　　肝細胞核因子(hepatocyte nuclear factors，HNFs)家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及CCAAT/增強子結合蛋白（C/EBP）等，是一組在肝細胞中優(yōu)勢表達的轉錄因子，相互作用并構成強大的轉錄因子網絡系統(tǒng)，在促進肝細胞分化和功能維持方面發(fā)揮重要作用。HNF3β，即翼狀螺旋轉錄因子FOXA2，主要表達于肝臟、胰腺、肺等。在肝臟發(fā)育及維持肝臟功能方面如糖脂代謝、膽汁酸代謝等具

3、有重要作用。前期研究利用HNF4α和HNF1α治療肝纖維化，并藉此提出利用轉錄因子治療肝纖維化的新策略。在本研究中將探討HNFs中另一個成員FOXA2對肝纖維化的可能治療作用及其作用機制。
　　在前期研究中，檢測了臨床肝纖維化病人的肝組織標本以及四氯化碳(Carbon Tetrachloride，CCl4)肝纖維化模型的小鼠肝組織標本，發(fā)現(xiàn)在肝纖維化組織中，F(xiàn)OXA2表達均較對照組下調。分離CCl4造模小鼠不同時期的小鼠原代肝細胞

4、及肝星狀細胞(Hepatic stellate cells,HSCs)，發(fā)現(xiàn)在肝纖維化過程中，肝細胞FOXA2表達逐漸下調而HSCs中的FOXA2卻逐漸升高。為進一步探究FOXA2在肝纖維化中的作用，構建了四種模式小鼠，結果顯示:特異性敲除肝細胞中FOXA2基因可促進肝纖維化發(fā)生;上調肝臟中FOXA2或特異性上調肝細胞中FOXA2表達均可改善肝纖維化;但特異性上調HSCs中FOXA2對肝纖維化進程并無顯著影響。基于前期研究結果，推測FO

5、XA2可能通過保護肝細胞來改善肝纖維化，并非通過抑制HSCs活化，但其具體機制尚未明確。
　　本課題在明確了FOXA2可有效治療肝纖維化的基礎上，進一步探討其抗肝纖維化的作用機制。
　　方法：
　　一、CCl4誘導肝纖維化動物模型的構建
　　按3∶1比例混勻植物油和CCl4，采用腹腔注射小鼠建立肝纖維化模型，注射劑量為0.25ml/kg，每周2次，連續(xù)4至5周。
　　二、于CCl4造模不同時間點，通過尾靜脈

6、注射不同病毒載體調控肝臟FOXA2表達，建立三種不同模式小鼠
　　1.肝細胞特異性敲除FOXA2的小鼠肝纖維化模型:
　　采用LoxP-Cre重組系統(tǒng)，6周齡的FOXA2loxP/loxP基因小鼠（美國杰克遜實驗室，022620）通過尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre（前期已構建完成）2×1011Vg/只，特異性敲除小鼠肝細胞FOXA2，2周后采用CCl4腹腔注射構建肝纖維化小鼠模型;
　　2.肝細胞特異性過表達FOX

7、A2的小鼠肝纖維化模型:
　　通過腺病毒載體pENN-AVV-TBG-PI-RBG（the Penn Vector Core，p1015-R）構建具肝細胞特異性的FOXA2過表達質粒，進一步包裝成病毒AAV8-TBG-FOXA2（已完成）。通過尾靜脈注射至CCl4造模一周的慢性肝纖維化小鼠模型中，特異上調肝細胞FOXA2表達。
　　3.肝臟過表達FOXA2的肝纖維化模式小鼠:
　　利用慢病毒載體pCDH-CMV-MCS

8、-EF1-copGFP（系統(tǒng)生物學）構建肝臟非特異性慢病毒LV-FOXA2（已完成），通過尾靜脈注射病毒LV-FOXA2于CCl4造模兩周的慢性肝纖維化小鼠模型中，非特異上調肝臟FOXA2表達。
　　三、FOXA2對肝纖維化過程中內質網應激和氧化應激的影響
　　分離小鼠原代肝細胞，通過Real-time RT-PCR分別檢測單純特異性敲除肝細胞FOXA2和特異性敲除肝細胞FOXA2后進行CCl4造模對肝臟特異性基因的影響。<

9、br>　　利用上述三種調控FOXA2的小鼠肝纖維化模型:肝細胞特異性敲除FOXA2、肝細胞特異性過表達FOXA2以及肝臟非特異性過表達FOXA2模式小鼠。采用Western blot和免疫組化分析各組小鼠肝臟中CHOP等內質網應激變化情況;
　　利用丙二醇(malondialdehyde，MDA)試劑盒檢測各組小鼠肝臟中MDA變化情況，通過Western blot檢測小鼠肝臟中Nitrotyrosine蛋白變化以明確氧化應激的變化

10、情況。
　　四、FOXA2對肝纖維化過程中細胞凋亡的影響
　　使用TUNEL試劑盒檢測肝細胞特異敲除FOXA2模式小鼠肝臟標本中的細胞凋亡情況;利用Western blot及免疫組化檢測不同模式小鼠肝組織標本中凋亡相關基因(Bax、Cleaved caspase3)的變化情況。
　　五、統(tǒng)計學分析
　　數(shù)據(jù)采用軟件SPSS18進行統(tǒng)計學分析。分析結果以均數(shù)±標準差表示，各組間統(tǒng)計分析采用方差分析(ANOVA)及t

11、檢驗等，以P＜0.05視為檢驗標準。
　　結果：
　　一、FOXA2可減輕肝纖維化進程中的內質網應激
　　1.特異性敲除肝細胞FOXA2可加重內質網應激，促進肝纖維化
　　Real-time RT-PCR結果顯示:未造模的條件下，小鼠成年后單純特異性敲除肝細胞FOXA2表達未能影響肝細胞中肝特異基因（糖脂代謝和肝酶合成相關）的表達;而小鼠經腹腔注射CCl4進行纖維化造模，肝特異性基因發(fā)生輕微變化;更重要的是，與對

12、照造模組相比，F(xiàn)OXA2H-KO+CCl4組小鼠原代細胞中肝特異性基因的轉錄表達顯著下降;說明在纖維化病理條件下，肝細胞中肝特異功能基因的正常轉錄需要FOXA2。
　　Western blot結果表明:單純特異性敲除肝細胞FOXA2未能誘發(fā)內質網應激，CCl4造模可導致內質網應激水平升高;在小鼠CCl4肝纖維化模型中，較對照造模組而言，F(xiàn)OXA2H-KO+CCl4組小鼠肝臟中CHOP表達顯著升高，提示特異性敲除肝細胞FOXA2可進

13、一步加重纖維化肝臟中的內質網應激。
　　免疫組化顯示:各組小鼠肝組織中的CHOP變化趨勢和Western blot結果一致。
　　2.特異性上調肝細胞FOXA2表達可抑制內質網應激，改善肝纖維化
　　Western blot結果顯示:FOXA2組較對照組而言，肝組織中的CHOP蛋白水平明顯下降。
　　3.過表達肝臟FOXA2可抑制內質網應激，減輕肝纖維化
　　Western blot結果提示:CCl4造模可

14、顯著誘發(fā)小鼠肝臟內的CHOP表達水平升高，過表達肝臟FOXA2后可抑制該蛋白水平的升高。
　　綜上，這些結果表明，內質網應激參與FOXA2調控肝纖維進程。
　　二、FOXA2可減輕肝纖維進程中的氧化應激
　　1.特異性敲除肝細胞FOXA2可促進氧化應激，加重肝纖維化
　　MDA比色法及Western blot結果顯示:CCl4可輕度升高纖維化肝臟中的氧化應激水平;在小鼠CCl4模型中，與對照造模組相比，特異性敲除

15、肝細胞FOXA2表達后MDA水平及Nitrotyrosine水平顯著升高，說明肝細胞特異性敲除FOXA2可進一步加重纖維化肝臟中的氧化應激水平。
　　2.特異性過表達肝細胞FOXA2可抑制氧化應激，改善肝纖維化
　　Western blot結果顯示:FOXA2組較對照組而言，肝組織中Nitrotyrosine蛋白水平明顯減少。
　　3.過表達肝臟FOXA2可抑制氧化應激，減輕肝纖維化
　　Western blot

16、結果提示:CCl4造?？娠@著誘發(fā)小鼠肝臟內Nitrotyrosine表達水平升高，過表達肝臟FOXA2后可抑制Nitrotyrosine蛋白的升高。
　　綜上，這些結果表明，氧化應激參與FOXA2調控肝纖維進程。
　　三、FOXA2調控肝纖維進程，與肝細胞凋亡相關
　　1.肝細胞特異性敲除FOXA2通過加重肝細胞凋亡促進肝纖維化
　　TUNEL結果顯示:單純特異性敲除肝細胞FOXA2的未造模小鼠與野生型未造模小鼠

17、相比，其肝組織中未見自發(fā)細胞凋亡;CCl4可誘發(fā)輕度細胞凋亡;更重要的是，F(xiàn)OXA2H-KO+CCl4組小鼠肝臟中細胞凋亡程度較對照造模組而言明顯加重;
　　Western blot檢測提示:FOXA2H-KO+CCl4組小鼠較對照組而言，Bax及Cleaved caspase3蛋白水平顯著升高，定量具統(tǒng)計學意義;
　　免疫組織化學法顯示:與Western blot中Cleaved caspase3的變化趨勢一致，且該蛋白主

18、要定植于肝細胞的細胞質中;說明肝細胞特異性敲除FOXA2可加重纖維化肝臟中的肝細胞凋亡，促進肝纖維化。
　　2.特異性上調肝細胞FOXA2表達可抑制細胞凋亡，減輕肝纖維化
　　Western blot結果顯示:較對照組而言，F(xiàn)OXA2組肝組織中凋亡相關基因Bax及Cleaved caspase3表達水平均下降。
　　免疫組織染色法趨勢與Western印跡法結果一致，Cleaved caspase3染色主要位于肝細胞胞漿

19、中。
　　3.上調肝臟FOXA2表達可抑制細胞凋亡，改善肝纖維化
　　Western blot結果提示:CCl4造?？缮险{小鼠肝臟內凋亡相關基因的表達，而特異性上調肝細胞中的FOXA2表達后能夠抑制這些基因蛋白的升高。
　　綜上提示，F(xiàn)OXA2通過調控肝細胞凋亡影響肝纖維進程。
　　結論：
　　一、CCl4誘導小鼠慢性肝纖維化損傷可誘導小鼠體內內質網應激及氧化應激，其可介導肝細胞凋亡。
　　二、FOX