IRHOM2通過調(diào)控TNF-α影響小鼠肺纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、肺纖維化是以彌漫性間質(zhì)纖維化為特征的一類疾病，其中50％以上原因不明，稱之為特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）。肺纖維化預(yù)后較差，治療不敏感，肺移植是目前終末期肺纖維化患者唯一有效的治療方法。肺纖維化致病機(jī)制不明，可能和肺損傷后炎癥反應(yīng)以及異常修復(fù)有關(guān)。
　　肺纖維化是肺損傷的重要階段，肺損傷后的修復(fù)大致可分為三個(gè)階段:炎癥反應(yīng)期，肉芽組織生成和細(xì)胞外基質(zhì)沉積期，基質(zhì)重構(gòu)和肉芽組織

2、分界期。損傷發(fā)生后，宿居的成纖維細(xì)胞活化，纖維細(xì)胞也被募集到損傷部位，并分化為平滑肌動(dòng)蛋白α(α-SMA)陽性的肌成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積，以促進(jìn)損傷修復(fù)和組織的完整性。有研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞反復(fù)的損傷修復(fù)，標(biāo)志性的出現(xiàn)在IPF患者和肺纖維化動(dòng)物模型中，纖維化標(biāo)記物α-SMA、Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ)等表達(dá)上調(diào)，同時(shí)上皮細(xì)胞骨架重建變?yōu)榧忓N形，最終轉(zhuǎn)化為間葉細(xì)胞。肺臟損傷修復(fù)的結(jié)果是纖維化還是恢復(fù)正常解剖結(jié)構(gòu)，取決于

3、肺泡內(nèi)滲出物及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積能否有效清除，過多的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積可導(dǎo)致組織纖維化。
　　促炎性因子TNF-α在肺纖維中起關(guān)鍵作用。早先研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α參與肺損傷后修復(fù)，在肺損傷后組織中高表達(dá)，且與肺損傷程度相關(guān)。TNF-α可直接或間接通過受體，刺激胞外基質(zhì)沉積，并上調(diào)纖維化標(biāo)志物Ⅰ型膠原和α-SMA的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過跨膜受體激酶，調(diào)控核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄，在肺纖維化中引起肌成纖維細(xì)胞的增殖分化，是肺纖維化

4、的重要致病途徑。
　　非活性的菱形蛋白2（inactive rhomboid-like protein2，IRHOM2）屬于rhomboid蛋白家族，目前發(fā)現(xiàn)的rhomboid蛋白家族成員豐富，有十余種，參與細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如rhomboid家族中的RHBDD3可抑制NK細(xì)胞TLR3通路的活化。Freeman等人研究發(fā)現(xiàn)IRHOM2是抗病原體防御和睡眠的調(diào)控蛋白。在微生物入侵時(shí)，巨噬細(xì)胞等會(huì)分泌TNF-α，并且將其轉(zhuǎn)移到胞膜處

5、，而后胞膜處的腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶(tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE)會(huì)促進(jìn)TNF-α的釋放。IRHOM2可以和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的TACE蛋白結(jié)合，促進(jìn)TACE離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到達(dá)胞膜發(fā)揮功能。所以，抑制IRHOM2蛋白表達(dá)，可導(dǎo)致TACE無法成熟，不能發(fā)揮以上功能。另外，有研究表明Rhbdf2（編碼IRHOM2）敲除小鼠關(guān)節(jié)炎癥明顯減輕，關(guān)節(jié)腫脹減輕、臨床評分降低，滑液驗(yàn)證關(guān)節(jié)侵蝕減輕，說明

6、IRHOM2在關(guān)節(jié)炎癥中的作用。
　　因此，IRHOM2可能通過TNF-α信號(hào)通路調(diào)控小鼠肺纖維化。通過研究觀察博來霉素誘導(dǎo)的野生小鼠肺組織及肺細(xì)胞中IRHOM2變化，以及調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2來觀察上皮間質(zhì)化的程度，有利于闡明IRHOM2在肺纖維化中的作用機(jī)制，為臨床尋找干預(yù)肺纖維化提供新的線索和靶點(diǎn)，為防治肺纖維化提供理論依據(jù)和臨床策略。
　　第一部分小鼠肺纖維化對肺組織及細(xì)胞IRHOM2及TNF-α的影響

7、>　　小鼠肺纖維化對肺組織中IRHOM2及TNF-α的影響
　　目的:建立小鼠肺纖維化模型，研究小鼠肺纖維化對肺組織中IRHOM2及TNF-α的影響
　　方法:C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組(n=6)，對照組(Con)、肺纖維化組(Fb)。模型組于第1天經(jīng)氣管給予鹽酸博來霉素(4mg/kg)，對照組經(jīng)氣管給予生理鹽水(2ml/kg)，第14天后取肺組織，通過心尖動(dòng)脈血?dú)夥治觯稳~組織HE及Masson病理學(xué)染色檢查，肺葉組織

8、羥脯氨酸含量檢測，肺葉組織濕干重比，測定評估肺功能改變及小鼠肺纖維化程度，并收集小鼠肺泡灌洗液(BALF) ELISA測定TNF-α水平，免疫組化法染色測定Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ)、平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)在肺組織中含量，Western Blot方法檢測α-SMA、collagen-Ⅰ以及IRHOM2蛋白，進(jìn)一步評價(jià)IRHOM2及其他相關(guān)蛋白在小鼠肺纖維化中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:與對照組相比，肺纖

9、維化組給藥后第14天成功誘發(fā)小鼠肺纖維化，心尖部動(dòng)脈血氧分壓降低，肺泡結(jié)構(gòu)大面積實(shí)變，肺泡腔縮小，遍布成纖維細(xì)胞，Masson染色可見大量藍(lán)色膠原纖維，肺葉羥脯氨酸含量及濕干重比增加，肺泡灌洗液中TNF-α增加;免疫組化顯示collagen-Ⅰ、α-SMA和FN在肺組織中含量增加;Western Blot顯示小鼠肺纖維后肺組織IRHOM2蛋白含量降低、collagen-Ⅰ和α-SMA增加。
　　結(jié)論:鹽酸博來霉素致小鼠肺纖維化可以

10、上調(diào)小鼠肺組織和肺泡灌洗液中TNF-α的含量，但I(xiàn)RHOM2蛋白水平降低。
　　小鼠肺纖維化對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞中IRHOM2及TNF-α的影響
　　目的:小鼠肺纖維化對Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AT-Ⅱ)和肺泡巨噬細(xì)胞（AM）中IRHOM2、TNF-α的影響
　　方法:C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組(n=6)，對照組(Con)、肺纖維化組(Fb)。模型組于第1天經(jīng)氣管給予鹽酸博來霉素(4mg/kg)，對照組經(jīng)氣管

11、給予生理鹽水(2ml/kg)，于第14天在戊巴比妥麻醉下，分離提取原代肺泡巨噬細(xì)胞和原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，純化后細(xì)胞孵箱培養(yǎng)。1、肺泡巨噬細(xì)胞純化后ELISA檢測細(xì)胞和培養(yǎng)液中TNF-α的含量。2、原代Ⅱ型上皮細(xì)胞純化培養(yǎng)24 h后，檢測細(xì)胞和培養(yǎng)液中TNF-α的含量。3、Western Blot方法檢測原代肺泡巨噬細(xì)胞和原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2蛋白的含量變化。
　　結(jié)果:與對照組相比，1、肺纖維化組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞及其

12、細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量增加。2、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的水平降低。3、肺纖維化組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中IRHOM2蛋白水平增加，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2蛋白水平降低。
　　結(jié)論:小鼠肺纖維化可以上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞及培養(yǎng)液中TNF-α的含量，并使IRHOM2蛋白水平增加;同時(shí)下調(diào)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量，并使IRHOM2蛋白水平減少。
　　第二部分引起Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2變化的主要因

13、素及IRHOM2在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用
　　目的:研究肺纖維化中，主要引起小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2變化的原因，并研究IRHOM2蛋白在肺纖維化主要細(xì)胞機(jī)制——上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。
　　方法:C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組(n=6)，對照組(AT-Con)提取純化原代Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，并用巨噬細(xì)胞純化后培養(yǎng)上清液培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞;纖維化因子組(AT-Fb)用肺纖維化小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液

14、培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞;博來霉素組(AT-BLM)則在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入博來霉素培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞;TNF-α組(AT-TNF)則在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入TNF-α培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞。Western Blot方法檢測4組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2含量的變化。
　　培養(yǎng)人Ⅱ型肺泡上皮A549細(xì)胞系平均接種六孔板中分為3組(n=3)，對照組(A-Con)為1640培養(yǎng)液;上皮間質(zhì)化組(A-EMT)在其1640培養(yǎng)液中加入鹽酸

15、博來霉素，IRHOM2蛋白敲減組(A-RNAi)則為慢病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中IRHOM2蛋白明顯下調(diào)，并在其1640培養(yǎng)液中加博來霉素培養(yǎng)。24 h后提取細(xì)胞蛋白，Western Blot方法檢測三組間代表上皮間質(zhì)化水平的collagen-Ⅰ和α-SMA含量。
　　結(jié)果:培養(yǎng)24 h后Western Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，博來霉素組Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2蛋白含量變化不明顯，而纖維化因子組及TNF-α組

16、中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2蛋白明顯降低。Western Blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，上皮間質(zhì)化組細(xì)胞中collagen-Ⅰ和α-SMA含量增加，IRHOM2蛋白敲減組間質(zhì)化程度介于對照組與上皮間質(zhì)化組之間。
　　結(jié)論:提示參與改變肺泡上皮細(xì)胞中IRHOM2表達(dá)量的直接因素可能是肺纖維化小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中的炎性因子，而非博來霉素，并且在上皮間質(zhì)化細(xì)胞模型中，IRHOM2敲減可以下調(diào)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞EMT指標(biāo)，提示可緩