轉錄因子FOXA2生物素標記體系構建及其互作蛋白鑒定.pdf

1、乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。乳腺癌作為威脅女性健康最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在中國上升趨勢明顯。乳腺癌細胞的生長特性是:能無限生長、具有轉化和轉移能力。因此通過對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展作用機制進行深入研究，以期為腫瘤治療方案及臨床耐藥提供新的靶點。
　　生物素Avi-tag技術是指在目的蛋白的N端或C端加上由15個氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)組成的受體肽小標簽，該小標簽可被生物素連接酶BirA特異性識別，并

2、且生物素連接酶可催化生物素轉移到靶標蛋白標簽上的賴氨酸殘基上，導致帶有標簽的靶標蛋白在體內能被生物素化。該生物素化過程為酶促反應，反應條件溫和，標記特異性強、專一性高，同時由于序列短小，僅僅只有15個氨基酸，對靶標蛋白的構象及活性影響極低。鏈霉親和素可以特異性地與生物素結合，結合力強。因此，可在嚴格的洗脫條件下分離出目標蛋白及與其蛋白特異性相互作用的復合體。
　　叉頭框(Forkhead box)家族蛋白被發(fā)現大量的存在于真菌及動

3、物體內，這個家族的主要特征是作為轉錄因子作用于DNA結合序列，于其DNA結合區(qū)域序列的極端保守性，并且在這類家族蛋白的尾部具有特殊的翼狀螺旋結構。FOXA2是Forkhead box轉錄因子家族的成員之一，FOXA2參與胚胎發(fā)育，同時抑制多種腫瘤細胞的轉移，并在參與細胞干性維持發(fā)揮重要作用。臨床上發(fā)現，在眾多腫瘤樣品如乳腺癌、肺癌等中發(fā)現FOXA2有較高水平的表達，FOXA2高表達或許與細胞的癌變有著密切的關聯(lián)。此外，FOXA2還參與多

4、種信號通路，包括調控致癌信號多種途徑。這些都暗示轉錄因子FOXA2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。
　　蛋白互作研究是后基因組時代一個重要研究內容，也是當前非常熱門研究領域。生物體內，與外界進行信號交換，都是通過配體與細胞表面的跨膜受體結合，而后通過蛋白-蛋白相互作用層層傳遞至細胞核中引起特定的生理生化反應。生物機體內每一個小分子都不是獨立存在的，而是通過與其它物質結合協(xié)同發(fā)揮作用，從而形成一個相互交叉緊密聯(lián)系的網絡?？刂瓢┌Y也

5、不能只抑制單一的信號通路，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是由多條不同信號通路共同參與、相互影響、相互作用的最終結果。通過以FOXA2為核心、尋找其互作蛋白，分析信號通路調節(jié)網絡，對于全面認識FOXA2在細胞中的生物學功能，具有十分重要的價值。
　　本課題構建了基于生物素Avi-tag的FOXA2真核表達載體，利用生物素與鏈霉親和素的高特異性、高親和力的結合性質對FOXA2蛋白進行純化，將所得的蛋白復合體進行考馬斯亮藍染色，質譜分析，然后通過生物

6、信息學進行對比分析，尋找FOXA2可能存在的互作蛋白，然后通過免疫共沉淀等分子生物學方法進行驗證，我們在研究中尋找到了FOXA2的互作蛋白FOXP2，并且通過臨床樣品的統(tǒng)計分析，發(fā)現FOXA2與FOXP2表達水平具有相關聯(lián)性。本研究主要包括兩點:1.建立了轉錄因子FOXA2生物素標記體系，實現了FOXA2在乳腺癌細胞中被生物素化，同時實現了且該蛋白Western Blotting、Pull-down等實驗中無需抗體的一步法應用，快速，經