草魚轉(zhuǎn)錄因子Runx1和Runx3的分離鑒定及其免疫功能研究.pdf

1、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor，Runx）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。哺乳動(dòng)物Runx家族包含3個(gè)成員：Runxl、Runx2和Runx3，它們?cè)诙喾N生理活動(dòng)中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。其中Runx1和Runx3在免疫系統(tǒng)中的功能更令人關(guān)注，主要參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖、分化和功能等。目前，雖然斑馬魚和河鲀的Runx家族成員及其輔助因子 CBFβ已被克隆和鑒定，但是 Runx1和 Runx3在魚

2、類的免疫學(xué)功能還未知。本論文以草魚為研究模型，首先鑒定了Runx1、Runx3及CBFβ的分子特征，然后提供它們參與免疫反應(yīng)的證據(jù)，最后闡明它們的免疫調(diào)節(jié)功能，特別是在介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β)調(diào)節(jié)作用中的地位。研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.草魚Runx1和Runx3的分離鑒定和誘導(dǎo)表達(dá)分析：（1）通過(guò)簡(jiǎn)并PCR和RACE PCR等多次PCR反應(yīng)，克隆獲得草魚Runx1五種

3、剪接體（Runx1 v1-5）和Runx3的cDNA序列。結(jié)構(gòu)特征分析、氨基酸多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析證明它們分別是哺乳動(dòng)物的Runx1和Runx3的同源基因。（2）Runx1的五種剪接體中， Runx1 v1-3具有完整的功能結(jié)構(gòu)域，包括轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域（transactivation domain， TAD)、抑制結(jié)構(gòu)域（inhibitory domain，ID)、PY模體及C末端VWRPY模體，而Runx1 v4-5缺乏TAD、I

4、D、PY及VWRPY等功能結(jié)構(gòu)域。組織分布檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Runx1 v1-3和Runx1 v4-5具有相似的組織分布特征，在胸腺中表達(dá)水平最高，其次是脾、腎、頭腎等組織，在外周血白細(xì)胞中表達(dá)較高；Runx3在胸腺和脾中表達(dá)水平最高，其次是外周血白細(xì)胞。（3）LPS和PHA均能刺激草魚外周血白細(xì)胞Runx1 v1-3、Runx1 v4-5和Runx3基因表達(dá)上調(diào)，而poly I:C只對(duì)Runx1 v1-3和Runx3有誘導(dǎo)作用。（4）嗜水氣單胞

5、桿菌感染促使草魚Runx1 v1-3和Runx3在頭腎、脾及胸腺組織中的表達(dá)不同程度增強(qiáng)，而Runx1 v4-5的表達(dá)上調(diào)僅發(fā)生在脾和胸腺組織。Runx1 v1-3和Runx1 v4-5在體內(nèi)外免疫刺激實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)出不同的時(shí)間動(dòng)力學(xué)特征，說(shuō)明它們的免疫功能可能存在差異；推測(cè)Runx1 v4-5可能作為一種天然存在的抑制劑，調(diào)控硬骨魚Runx1信號(hào)通路中過(guò)度的激活反應(yīng)。
　　2.草魚Runx輔助因子CBFβ的分離鑒定和表達(dá)特征：（1）

6、通過(guò)多種PCR技術(shù)，分離獲得草魚 CBFβ的cDNA序列；氨基酸多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析證明它是哺乳動(dòng)物CBFβ的同源基因。（2）3D同源建模表明草魚CBFβ的空間結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物CBFβ的空間結(jié)構(gòu)相似度極高；CBFβ在結(jié)構(gòu)上的高度保守性暗示了其在進(jìn)化過(guò)程中的功能保守性。（3）CBFβ和Runx1、Runx3具有相似的組織分布特征，在胸腺中表達(dá)水平最高，其次是脾、頭腎，在外周血白細(xì)胞中表達(dá)較高。（4） CBFβ主要定位于細(xì)胞核，證明了其

7、作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的基本特性。（5）LPS、PHA和poly I:C均能刺激草魚外周血白細(xì)胞CBFβ基因表達(dá)上調(diào)。（6）嗜水氣單胞桿菌感染草魚后，CBFβ基因在頭腎、脾和胸腺組織中表達(dá)水平上調(diào)，進(jìn)一步確證CBFβ參與了硬骨魚免疫反應(yīng)。
　　3.草魚Runx1和Runx3的功能鑒定：（1）Runx1五種剪接體和Runx3無(wú)需刺激，即能夠直接入核，證明它們作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的基本特性。（2）進(jìn)一步探討草魚Runx1和Runx3對(duì)T

8、細(xì)胞亞型的標(biāo)志細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響。采用Runx1抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)：草魚外周血白細(xì)胞中LPS、PHA和poly I:C誘導(dǎo)草魚細(xì)胞因子 IFN-?、IL-17A/F1和 IL-17A/F2基因的表達(dá)，這些刺激作用被阻斷Runx1信號(hào)所抑制。但阻斷Runx1信號(hào)并不影響poly I:C對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)的上調(diào)。（3）由于沒(méi)有特異的Runx3抑制劑，采用過(guò)表達(dá)草魚Runx3方法的結(jié)果顯示：在草魚腎細(xì)胞系（Grass carp

9、kindney cell lines，CIK）中，過(guò)表達(dá)草魚Runx3上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)，而抑制轉(zhuǎn)錄因子GATA3的表達(dá)，但過(guò)表達(dá)Runx3或/和CBFβ對(duì)Foxp3的基因表達(dá)水平無(wú)影響。（4）研究草魚Runx1、Runx3和輔助因子CBFβ的相互作用關(guān)系，結(jié)果顯示：草魚Runx1和Runx3之間并無(wú)相互作用關(guān)系，但過(guò)表達(dá)Runx1的兩種代表性剪接體和Runx3均顯著誘導(dǎo)CBFβ基因的表達(dá)，提示CBFβ可能參與Runx1和Ru

10、nx3的調(diào)節(jié)作用。但是過(guò)表達(dá)的CBFβ并沒(méi)有協(xié)同 Runx3的作用，可能因?yàn)閮?nèi)源性的CBFβ足以滿足 Runx3發(fā)揮功能，或者Runx3-CBFβ的協(xié)同作用還需要其它轉(zhuǎn)錄因子的參與。
　　4.草魚TGF-β免疫調(diào)節(jié)作用中Runx1和Runx3的表達(dá)和功能研究：（1）在草魚外周血白細(xì)胞中，重組的草魚TGF-β1上調(diào)草魚CBFβ基因的表達(dá)，而對(duì)Runx1 v1-3和 Runx1 v4-5基因的表達(dá)存在先上調(diào)再下調(diào)的雙重調(diào)節(jié)作用，提示它

11、們?cè)赥GF-β的免疫調(diào)節(jié)作用中不同的誘導(dǎo)表達(dá)特征。（2）特別地，與誘導(dǎo)CBFβ和Runx1表達(dá)比較，TGF-β1更顯著提高Runx3的mRNA水平。為強(qiáng)化該結(jié)果，本研究還檢測(cè)了草魚 TGF-β1對(duì) Runx3蛋白表達(dá)的影響，為此首先制備和鑒定草魚 Runx3多克隆抗體。WB分析顯示Runx3多克隆抗體能識(shí)別分子量約為49 KDa的Runx3重組蛋白和外周血白細(xì)胞中的內(nèi)源性Runx3蛋白（分子量約為46 KDa），證明了該抗體的有效性。采

12、用該抗體的WB的結(jié)果顯示TGF-β1刺激Runx3的蛋白高表達(dá)，說(shuō)明Runx3可能是Runx家族中TGF-β1作用的主要成員。（3）為檢驗(yàn)Runx1和 Runx3參與 TGF-β調(diào)節(jié)作用的假設(shè)，在外周血白細(xì)胞中研究在 TGF-β1抑制c-Myc表達(dá)過(guò)程中Runx1和Runx3的功能。具體地，抑制Runx1信號(hào)放大了TGF-β1對(duì)c-Myc的抑制作用，提示Runx1可能是TGF-β1調(diào)節(jié)c-Myc表達(dá)的負(fù)調(diào)控因素。相反地，過(guò)表達(dá)Runx3

13、反而放大TGF-β1對(duì)c-Myc表達(dá)的抑制作用，提示Runx3可能促進(jìn)了TGF-β1的該調(diào)節(jié)作用。為明確Runx3的上述功能，進(jìn)一步構(gòu)建Runx3顯性失活質(zhì)粒，在CIK中過(guò)表達(dá)該質(zhì)粒后c-Myc的表達(dá)明顯上調(diào)，但TGF-β1能夠抑制該刺激作用。結(jié)合上述（2）的結(jié)果，即TGF-β1明顯刺激Runx3的產(chǎn)生，這些結(jié)果提示TGF-β1可能通過(guò)誘導(dǎo)Runx3的產(chǎn)生來(lái)抑制c-Myc的表達(dá)。但Runx1和Runx3在TGF-β1調(diào)節(jié)c-Myc表達(dá)中

14、發(fā)揮不同功能的機(jī)制有待研究。（4）進(jìn)一步，在外周血白細(xì)胞中研究在 TGF-β1調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)新分子 nIL-1F表達(dá)過(guò)程中Runx1和Runx3的功能。結(jié)果顯示TGF-β1抑制nIL-1F的表達(dá)，但Runx1和Runx3均沒(méi)有參與TGF-β1的該抑制作用，提示Runx1和Runx3并沒(méi)有參與TGF-β1的所有調(diào)節(jié)活動(dòng)。
　　總之，本論文在闡明草魚Runx1、Runx3及CBFβ的分子特征基礎(chǔ)上，提供它們參與了魚類免疫反應(yīng)的證據(jù)，首次