瘢痕疙瘩CDC2L1、RUNX3和CAMTA1基因突變的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、【目的】 瘢痕疙瘩(keloid)是整形外科基礎(chǔ)研究的重要課題,其根本形成機(jī)制迄今尚未查明,尋找瘢痕疙瘩的相關(guān)調(diào)控基因已成為當(dāng)前瘢痕研究的熱點(diǎn)之一。本課題組在前期研究中成功應(yīng)用比較基因組雜交技術(shù)(CGH)成功構(gòu)建病理性瘢痕染色體變異頻率圖譜,證實(shí)在1號(hào)染色體短臂末端存在DNA拷貝數(shù)的高頻率缺失,并通過(guò)微衛(wèi)星多態(tài)分析發(fā)現(xiàn)在1p36區(qū)域存在基因雜合性缺失(LOH),提示該區(qū)域可能存在相關(guān)瘢痕抑制基因。單核昔酸多態(tài)性(Single N

2、ucleotide Polymorlahisms,SNP)是同一物種不同個(gè)體間染色體上遺傳密碼單個(gè)堿基的變化,主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性,包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入或缺失等。SNP 是繼RFLP、SSR 之后的第三代分子標(biāo)記。盡管原則上有 4 種核苷酸,但SNP通常具雙等位基因多態(tài)性,其突變率相當(dāng)?shù)?,是一種穩(wěn)定的突變,比之前的分子標(biāo)記更為有用。變性高效液相色譜分析技術(shù)(denaturing hi

3、gh performance liquid chromatography,DHPLC)是一種高通量篩選基因組DNA序列變異的新方法,在遺傳做圖和定位克隆致病基因,基因突變分析等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。DNA測(cè)序(DNA sequencing)技術(shù)是一種最為精確的分子診斷技術(shù),在遺傳性疾病和腫瘤的診斷領(lǐng)域內(nèi)占有重要地位,目前主要應(yīng)用于鑒定基因,檢測(cè)突變,分析噬菌體文庫(kù)等方面。這兩種方法巳分別被廣泛應(yīng)用于腫瘤基因檢測(cè),但是,兩者結(jié)合應(yīng)用于瘢痕疙

4、瘩目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題采用變性高效液相色譜分析技術(shù)加DNA測(cè)序技術(shù),對(duì)DNA拷貝數(shù)高頻率缺失的1p36區(qū)域的目前研究熱點(diǎn)基因片段RUNX3、CAMTA1 和 CDC2L1進(jìn)行篩查,檢測(cè)瘢痕疙瘩相關(guān)基因突變情況,尋找可能存在的瘢痕疙瘩抑制基因并精確定位其在染色體上的位置,以期從基因水平闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制,為臨床上進(jìn)行有效的治療和預(yù)防奠定基礎(chǔ)。 【方法】 收集13例患者瘢痕疙瘩組織和血液標(biāo)本,分別抽提出相應(yīng)基因組

5、DNA,在經(jīng)瘢痕疙瘩染色體變異頻率圖譜和微衛(wèi)星多態(tài)分析證實(shí)的DNA拷貝數(shù)高頻率缺失的1號(hào)染色體短臂末端區(qū)域,采用目前國(guó)外研究報(bào)道較多 RUNX3 基因RH120480、CAMTA1 基因 G65551、SHGC-149152 以及 CDC2L1 基因 EXON7和 EXON11 片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,回收純化后進(jìn)行基因組變性高效液相色譜分析加DNA測(cè)序分析,將瘢痕組織的DNA序列分別與血液和Genebank的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行比較、分析所檢測(cè)基

6、因片段SNP位點(diǎn)。 【結(jié)果】 研究顯示,所選取的五條基因片段,在血液標(biāo)本中均未發(fā)現(xiàn)突變,而瘢痕疙瘩組織的相關(guān)堿基序列經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)有多個(gè)SNP位點(diǎn):而且是多位點(diǎn)、多類(lèi)型的。具體變化情況如下: (1)本研究所選取的5個(gè)基因片段 RUNX3 基因 G56267、CAMTA1 基因G65551、SHGC-149152、CDC2L1 基因 EXON7 和 EXON11,經(jīng)PCR擴(kuò)增后將PCR 反應(yīng)液送 Transgenomi

7、c 公司開(kāi)發(fā)的 WAVEDHPLC 系統(tǒng)檢測(cè) DNA,DHPLC篩查結(jié)果顯示在擴(kuò)增片段中出現(xiàn)雜合峰與純合峰兩種情況,血液樣品均為單個(gè)色譜峰顯示為純合鏈;瘢痕疙瘩組織樣品為雙峰則表示是雜合異源雙鏈。出現(xiàn)雜合峰顯示有突變的異源雙鏈存在。 (2)RUNX3 基因 RH120480:根據(jù) DHPLC 篩查結(jié)果,選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進(jìn)行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織DNA樣本中,有12例發(fā)現(xiàn)突變,突變率為92.3%。發(fā)

8、現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn),其中11例患者的第96位堿基A的缺失、12 例患者的第279位堿基的C的插入突變。瘢痕疙瘩組織中 RUNX3 基因 RH120480 片斷的突變呈多態(tài)性,為多位點(diǎn)、多類(lèi)型基因突。 (3)CAMTA1 基因 G65551:根據(jù) DHPLC 篩查結(jié)果,選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進(jìn)行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織 DNA 樣本中,有12例發(fā)現(xiàn)突變,突變率為92.3%。發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn),其中9例患者的第

9、54位堿基G/T的顛換、12例患者的第412位堿基的C的缺失突變。瘢痕疙瘩組織中CAMTA1基因G65551片斷的突變呈多態(tài)性,為多位點(diǎn)、多類(lèi)型基因突變。 (4)CAMTA1 基因 SHGC-149152:根據(jù) DHPLC 篩查結(jié)果,選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進(jìn)行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織DNA 樣本中,有10例發(fā)現(xiàn)突變,突變率為76.9%。發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn),為第178位堿基的C的缺失突變。瘢痕疙瘩組織中 C

10、AMTA1 基因 SHGC-149152片斷的突變呈多態(tài)性。 (5)CDC2L1 基因 EXON7:根據(jù) DHPLC 篩查結(jié)果,選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進(jìn)行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織DNA樣本中,有12例發(fā)現(xiàn)突變,突變率為92.3%。發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn),其中8例患者的第113位堿基G缺失、12例患者的第192位堿基的C的插入突變。瘢痕疙瘩組織中CDC2L1 基因 EXON7 片斷的突變呈多態(tài)性,為多位點(diǎn)、多類(lèi)

11、型基因突變。 (6)CDC2L1 基因EXON11:根據(jù)DHPLC 篩查結(jié)果,選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進(jìn)行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織 DNA 樣本中,有9例發(fā)現(xiàn)突變,突變率為69.2%。發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn),為第68位堿基的A/C的顛換突變。瘢痕疙瘩組織中CDC2L1基因EXON11片斷的突變呈多態(tài)性。 【結(jié)論】 瘢痕疙瘩組織的5種基因片段中均發(fā)現(xiàn)突變。RUNX3 作為腫瘤抑制因子,該基因一旦缺

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