RUNX3在瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制中的作用及其表達(dá)與Pa-PDT治療療效的關(guān)系.pdf

1、瘢痕疙瘩是一種特殊的瘢痕類(lèi)型，是一種皮膚上的結(jié)締組織腫瘤，在形態(tài)學(xué)方面，其腫塊隆起于皮膚的表面，表面光滑，質(zhì)地堅(jiān)硬，界限欠規(guī)則，在組織學(xué)方面，成纖維細(xì)胞過(guò)度增生，細(xì)胞外基質(zhì)成分增加，膠原蛋白過(guò)度沉積，具有過(guò)度生長(zhǎng)、病變的發(fā)展超出原損傷界限、呈瘤樣增生，且鄰近組織也受到相應(yīng)的侵犯、始終不發(fā)生退化和單純手術(shù)治療后常出現(xiàn)復(fù)發(fā)現(xiàn)象，在臨床上，伴有不同程度的瘙癢和疼痛，常造成功能障礙和外形破壞而影響美觀和病人的心理，嚴(yán)重的損害了病人的生活質(zhì)量。<

2、br>　　光動(dòng)力療法是醫(yī)治惡性腫瘤的方法之一，它在不損害健康組織的情況下，在腫瘤組織中利用一種光敏劑的光動(dòng)力殺傷癌細(xì)胞的作用和選擇性聚集作用，造成腫瘤組織的特定部位受到損害。光敏劑的性質(zhì)可直接影響光動(dòng)力療法的治療效果，因此光敏劑的發(fā)展對(duì)光動(dòng)力療法的發(fā)展具有重要的意義。脫鎂葉綠酸（Pa）一個(gè)新的成熟的光敏劑，有抗癌活躍性和最低毒性已被很多研究者所報(bào)道。脫鎂葉綠酸-光動(dòng)力療法（Pa-PDT）它在各種類(lèi)型的癌癥中增加細(xì)胞凋亡和減少癌細(xì)胞的增殖

3、能力。Pa-PDT治療瘢痕疙瘩的療效及其作用機(jī)制的研究尚無(wú)報(bào)告。因此采用Pa-PDT，探索治療瘢痕疙瘩的新的方法。最近研究的腫瘤治療重點(diǎn)在是患者的個(gè)性化治療。分析每個(gè)瘢痕疙瘩病人，根據(jù)病人的需要制定和實(shí)施有效的治療方案。最近,一些研究人員已經(jīng)表明,runt-related轉(zhuǎn)錄因子3(RUNX3)是一種預(yù)測(cè)Pa-PDT敏感性的分子目標(biāo)。
　　目的:闡明RUNX3在瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制中的作用,探討Pa-PDT對(duì)瘢痕疙瘩的治療效果,并進(jìn)一

4、步研究RUNX3表達(dá)對(duì)瘢痕疙瘩Pa-PDT敏感性的影響。同時(shí)用瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞建立瘢痕疙瘩裸鼠模型。
　　方法：
　　1）利用瘢痕疙瘩病理組織原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞；
　　2）利用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Vimentin,α-SMA及type I collagen的表達(dá)；
　　3）利用3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl Tetr-azoli

5、um bromide(MTT) assay探討Pa對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性并分析細(xì)胞Pa-PDT的可行性；
　　4）實(shí)時(shí)定量PCR分析瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制和凋亡相關(guān)基因：比較性地研究用Pa-PDT處理過(guò)和未處理過(guò)的成纖維細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原、I型膠原蛋白表達(dá)；
　　5）ROS生成：熒光探針,2′7′dichlorofluorescin diacetate dye是用于檢測(cè)每一組表達(dá)的成纖維細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi) ROS水平；

6、　　6） Pa-PDT后評(píng)估凋亡細(xì)胞死亡：比較性的研究?jī)H用Pa處理過(guò)的成纖維細(xì)胞和接受Pa-PDT處理過(guò)的成纖維細(xì)胞兩組中凋亡細(xì)胞死亡；
　　7）Pa-PDT導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：通過(guò)免疫印跡分析，比較性的研究 Pa處理過(guò)的成纖維細(xì)胞組和Pa-PDT處理過(guò)的成纖維細(xì)胞組中的半胱天冬酶-3,活化型半胱天冬酶-3和降解產(chǎn)物表達(dá)；
　　8）外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩樣本的免疫組織化學(xué)，檢測(cè)瘢痕疙瘩組織中RUNX3的表達(dá)及其意義；

7、>　　9）利用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中RUNX3的表達(dá)；
　　10）利用針對(duì)RUNX3小干擾RNA壓低 RUNX3的表達(dá)，觀察瘢痕疙瘩纖維細(xì)胞PCNA表達(dá)的改變；
　　11）利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Pa-PDT對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞 RUNX3表達(dá)的影響；
　　12）比較觀察Pa-PDT對(duì)RUNX3陽(yáng)性細(xì)胞株及陰性細(xì)胞株的療效，針對(duì)Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PCNA，I型膠原蛋白的表達(dá)，RO

8、S生成及凋亡發(fā)生作比較；
　　13）在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中利用針對(duì)RUNX3小干擾RNA壓低 RUNX3的表達(dá)，觀察Pa-PDT療效的改變；
　　14）建立瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞裸鼠動(dòng)物模型：體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞與細(xì)胞基底膜基質(zhì)膠（Matrigel）混合后以細(xì)胞濃度為1.0×107/ml、3.0×107/ml、5.0×107/ml接種于裸鼠皮下，接種量為0.1ml，觀察瘤體形成和生長(zhǎng)情況，篩選適宜接種濃度；用已形成的瘢痕

9、疙瘩瘤體進(jìn)行體內(nèi)傳代，建立移植模型。
　　結(jié)果：
　　1）成功培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞并命名為KF1，KF2，KF3，KF4及KF5；
　　2)原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中檢測(cè)到波形蛋白,α-SMA,和I型膠原蛋白的表達(dá)；
　　3）Pa對(duì)四組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)較低的細(xì)胞毒性及充分的積累；
　　4）Pa-PDT嚴(yán)重影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活力；
　　5）經(jīng)過(guò)Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中增殖細(xì)胞核

10、抗原、I型膠原蛋白表達(dá)減少；
　　6）經(jīng)過(guò)Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ROS生成顯著增高；
　　7）經(jīng)過(guò)Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中調(diào)亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多；
　　8）經(jīng)過(guò)Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中cleaved caspase-3及cleaved-PARP的表達(dá)顯著增高；
　　9）RUNX3的核表達(dá)在16個(gè)(50％)瘢痕疙瘩組織樣本中被發(fā)現(xiàn)，但在6個(gè)正常皮膚樣本中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。在瘢痕疙瘩組織中 R

11、UNX3的核表達(dá)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖指數(shù)及伴有臨床癥狀正相關(guān)；
　　10) RUNX3的蛋白表達(dá)可在KF1，KF2中檢測(cè)到，但在 KF3，KF4及KF5中未檢測(cè)到RUNX3蛋白表達(dá)；
　　11）在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中利用針對(duì)RUNX3小干擾RNA壓低 RUNX3的表達(dá)，可觀察到PCNA表達(dá)降低；
　　12）Pa-PDT可引起瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中 RUNX3表達(dá)降低；
　　13）Pa-PDT后與RUNX3陰性

12、細(xì)胞株相比PCNA及type I collagen的降低，ROS生成及凋亡細(xì)胞的增多都在RUNX3陽(yáng)性細(xì)胞株更明顯；
　　14）在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中利用針對(duì)RUNX3小干擾RNA壓低 RUNX3的表達(dá)可降低Pa-PDT的細(xì)胞毒性；
　　15）成功建立瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞裸鼠動(dòng)物模型，并篩選出較適宜的細(xì)胞接種濃度為5.0×107/ml，體內(nèi)傳代后瘤體依然存活增大，二者組織病理未見(jiàn)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1）經(jīng)過(guò)

13、Pa-PDT后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中ROS生成顯著增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，抑制成纖維細(xì)胞增殖；
　　2）在瘢痕疙瘩組織中RUNX3的核表達(dá)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖指數(shù)及伴有臨床癥狀正相關(guān)；
　　3）Pa-PDT嚴(yán)重影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生存率。此細(xì)胞毒性明顯依賴于 RUNX3的表達(dá)；
　　4）ROS生成和凋亡細(xì)胞的數(shù)量的增多與RUNX3表達(dá)正相關(guān)；
　　5）裸鼠皮下接種人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞可建立瘢痕疙瘩裸鼠