基因突變敏感性分子開關(guān)檢測(cè)HIV-1耐藥基因突變.pdf

1、目的：利用高保真聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)，建立對(duì)HIV-1七個(gè)耐藥突變位進(jìn)行快速篩查的技術(shù)平臺(tái)，采用單一PCR和多重PCR相結(jié)合，檢測(cè)耐藥基因相關(guān)突變的有無，為HIV耐藥性評(píng)估提供依據(jù)，指導(dǎo)HIV患者合理用藥。
　　方法：將包含HIV-1耐藥突變的PCR產(chǎn)物克隆至pMD-19-T載體，通過含氨芐的LB平板篩選陽性克隆，挑選菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒DNA。對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增初步確定陽性克隆，并通過測(cè)序分析確證，獲得包含H

2、IV-1耐藥突變相對(duì)應(yīng)的野生型質(zhì)粒模板。突變型模板直接由公司合成，包含目前已知的HIV-1耐藥突變二十七個(gè)，本研究選擇七個(gè)高頻突變位點(diǎn)建立快速檢測(cè)體系。所選七個(gè)突變位點(diǎn)分別是M41L(ATG/CTG)、K65R(AAA/AGA)、T69N(ACT/AAT)、M184V(ATG/GTG)、V75I(GTA/ATA)、V82A(GTC/GCC)和L90M(TTG/ATG)。實(shí)驗(yàn)以這七個(gè)突變位點(diǎn)為檢測(cè)靶點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)3’末端與野生型基因位點(diǎn)或突

3、變基因位點(diǎn)配對(duì)的引物，硫化磷酸修飾3’末端并偶聯(lián)高保真DNA聚合酶構(gòu)成的基因突變敏感性分子開關(guān)。首先在不同體系分別對(duì)含有相應(yīng)七個(gè)突變的突變質(zhì)粒模板及野生型質(zhì)粒模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，并通過凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分析；然后在同一體系同時(shí)對(duì)含有相應(yīng)七個(gè)突變的突變質(zhì)粒模板及野生型質(zhì)粒模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，并通過凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分析；最后結(jié)合熒光定量分析進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：在不同反應(yīng)體系分別對(duì)七個(gè)熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)。在一定的反應(yīng)條件及反應(yīng)

4、體系下，特異性野生檢測(cè)引物與野生模板配對(duì)得以延伸；而與突變模板不配對(duì)則不能延伸。當(dāng)特異性突變檢測(cè)引物與突變模板配對(duì)，引物得以延伸；而與野生模板不配對(duì)則不能延伸。結(jié)果顯示，使用野生型質(zhì)粒模板，該方法僅能使野生型等位基因相關(guān)引物得以延伸，而突變等位基因位點(diǎn)特異性引物不能被延伸。反之，使用突變質(zhì)粒模板，該方法僅能使突變型等位基因位點(diǎn)相關(guān)引物得以延伸，而野生型等位基因位點(diǎn)特異性引物不能被延伸。在同一反應(yīng)體系同時(shí)對(duì)以上熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)。同樣，完全

5、配對(duì)引物能被延伸，不完全配對(duì)引物不能被延伸。分子開關(guān)對(duì)上述七個(gè)位點(diǎn)的識(shí)別敏感性大部分可達(dá)到101~109拷貝，特異性分別為104~105拷貝，這一特定引物擴(kuò)增特定模板的特異性在突變與野生序列之間的達(dá)到3個(gè)或3個(gè)以上對(duì)數(shù)級(jí)，能有效早期檢測(cè)耐藥突變。
　　結(jié)論：高保真酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)可用于已知基因突變的檢測(cè)，除可用于檢測(cè)某些遺傳性突變外，還可以檢測(cè)耐藥基因突變。高保真DNA聚合酶偶聯(lián)硫化修飾引物構(gòu)成的突變敏感性分子開關(guān)能夠快