基因突變敏感性分子開(kāi)關(guān)檢測(cè)β地中海貧血.pdf

1、目的：采用高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的基因突變敏感性分子開(kāi)關(guān)準(zhǔn)確、快速檢測(cè)β地中海貧血基因突變。
　　方法：首先提取正常人血液基因組DNA，根據(jù)已知中國(guó)人群β珠蛋白基因熱點(diǎn)突變CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及 CD26區(qū)域序列，分別設(shè)計(jì)引入突變位點(diǎn)的擴(kuò)增引物，利用低保真酶進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，將其PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體，得到β地中海貧血常見(jiàn)的六個(gè)突變位點(diǎn)的基因突變克?。篊D

2、41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26。然后以這六個(gè)突變位點(diǎn)為檢測(cè)靶點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)3’末端與野生型基因位點(diǎn)或突變型基因位點(diǎn)配對(duì)的引物，硫化磷酸修飾后偶聯(lián)高保真DNA聚合酶構(gòu)成基因突變敏感性分子開(kāi)關(guān)。首先在不同體系分別對(duì)含有相應(yīng)突變位點(diǎn)的六個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒模板及正常人基因組DNA模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分析；然后在同一體系中同時(shí)對(duì)含有相應(yīng)突變位點(diǎn)的六個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒模板及正常人

3、基因組DNA模板進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分析；最后對(duì)已知分別含有CD26和TATAbox-28突變位點(diǎn)的病人DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：在不同反應(yīng)體系分別對(duì)六個(gè)熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，使用正常人的染色體DNA樣本，該方法僅能使野生型等位基因相關(guān)引物得以延伸，而突變型等位基因位點(diǎn)特異性引物不能被延伸。反之，使用突變質(zhì)粒模板，該方法僅能使突變型等位基因位點(diǎn)相關(guān)引物得以延伸，而野生型等位基因位點(diǎn)特異性引物不能

4、被延伸。在同一反應(yīng)體系同時(shí)對(duì)以上熱點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)。同樣，完全配對(duì)引物能被延伸，不完全配對(duì)引物不能被延伸。對(duì)分別含有CD26和TATAbox-28突變位點(diǎn)的病人DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，與含CD26突變位點(diǎn)的病人DNA模板配對(duì)的突變引物有產(chǎn)物，不配對(duì)的無(wú)產(chǎn)物；與含TATAbox-28突變位點(diǎn)的病人DNA模板配對(duì)的突變引物有產(chǎn)物，不配對(duì)的無(wú)產(chǎn)物。
　　結(jié)論：
　　1.成功獲得可用于基因檢測(cè)技術(shù)研發(fā)的人工突變的地中海貧血基因突變陽(yáng)性模板