突變敏感性分子開關(guān)篩查AAID熱點(diǎn)基因突變的條件優(yōu)化與應(yīng)用研究.pdf

1、目的：利用高保真聚合酶結(jié)合硫代磷酸化修飾的特異性檢測引物構(gòu)成的突變敏感性分子開關(guān)，建立能夠準(zhǔn)確、快速識別mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三個與AAID密切相關(guān)的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)檢測平臺。通過該方法檢測mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三個突變位點(diǎn)的有無，來指導(dǎo)AmAn的合理用藥，預(yù)防AAID的發(fā)生。
　　方法：以已構(gòu)建好的同時包含mtDNA12S rRNA基

2、因A1555G、C1494T、961delT三個位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒為模板，利用高保真聚合酶結(jié)合硫代磷酸化修飾的特異性檢測引物構(gòu)成的突變敏感性分子開關(guān)，對突變型質(zhì)粒模板和野生型質(zhì)粒模板分別進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，將其PCR產(chǎn)物通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。通過調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)過程中退火溫度、引物濃度、模板濃度等，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，然后在同一反應(yīng)體系中對包含mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三位點(diǎn)突變型

3、質(zhì)粒模板和野生型質(zhì)粒模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，并通過凝膠成像系統(tǒng)對其 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。采用優(yōu)化好的多重 PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，確定所建立的檢測平臺的靈敏性。最后利用高保真酶介導(dǎo)突變敏感性分子開關(guān)對臨床志愿者的血液基因組DNA樣本進(jìn)行基因突變的篩查。
　　結(jié)果：在一定的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，突變檢測引物與野生模板不配對，無PCR產(chǎn)物，而與突變模板相配對，則有PCR產(chǎn)物。在優(yōu)化 PCR反應(yīng)退火溫度的過程中，隨著退火溫度的升高，突變敏

4、感性分子開關(guān)的特異性提高。在不同的反應(yīng)體系中，重組質(zhì)粒經(jīng)定量后，稀釋成108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL濃度梯度作為模板，然后再以稀釋的質(zhì)粒分別作為模板，本課題所構(gòu)建的突變敏感性分子開關(guān)檢測平臺對于A1555G、C1494T的檢測靈敏度達(dá)到103拷貝，特異性達(dá)到106拷貝，961delT的檢測靈敏度達(dá)到102拷貝，特異性達(dá)到105拷貝，在同一反應(yīng)體系的多重引物延伸反應(yīng)中，對三位點(diǎn)突變進(jìn)行同時檢測，突

5、變重組質(zhì)粒經(jīng)定量后，稀釋成108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL濃度梯度作為模板，本課題所構(gòu)建的突變敏感分子開關(guān)檢測平臺對于三位點(diǎn)同時檢測的靈敏度達(dá)到104拷貝。突變敏感性分子開關(guān)對50例臨床志愿者mtDNA12S rRNA基因 A1555G、C1494T、961delT突變的篩查均沒有發(fā)現(xiàn) A1555G、C1494T、961delT突變攜帶者。
　　結(jié)論：利用突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)，建立了快速篩