突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)在乳腺癌PIK3CA基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：研究高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)在乳腺癌PIK3CA基因突變快速檢測(cè)中的應(yīng)用，并分析PIK3CA基因突變與乳腺癌之間的關(guān)系。
　　 方法：收集蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院2008年至2011年乳腺癌組織標(biāo)本90例及乳腺纖維腺瘤和癌旁乳腺組織（超過(guò)病灶周圍5cm）各10例，應(yīng)用高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)檢測(cè)其PIK3CA基因第9外顯子的G1633A(E545K)突變和第20外顯子的A3140G(

2、H1047R)突變。首先，選取PIK3CA基因20號(hào)外顯子A3140G(H1047R)突變?yōu)闄z測(cè)靶點(diǎn)，驗(yàn)證突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)在基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。具體步驟為：①提取健康人的基因組DNA、乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤和癌旁乳腺組織的基因組DNA并定量；②以健康人基因組DNA為模板通過(guò)PCR體外定點(diǎn)突變技術(shù)，獲得含有PIK3CA基因3140位點(diǎn)為突變位點(diǎn)（堿基為G）的DNA片段；③用PCR反應(yīng)擴(kuò)增健康人基因組DNA，獲得含有PIK3C

3、A基因3140位點(diǎn)為野生位點(diǎn)(堿基為A)的DNA片段；④將獲得的突變和野生的DNA片段連接質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，建立突變和野生的質(zhì)粒模板并定量；⑤分別設(shè)計(jì)與PIK3CA基因3140位點(diǎn)突變堿基和野生堿基配對(duì)的3’末端硫化磷酸修飾的引物對(duì)，驗(yàn)證高保真酶及引物的靈敏度和特異性；⑥以乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤和癌旁乳腺組織的基因組DNA為模板，分別用驗(yàn)證好的突變檢測(cè)引物和野生檢測(cè)引物進(jìn)行高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的PCR反應(yīng)，利用凝膠成

4、像系統(tǒng)對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行突變檢測(cè)分析。然后，將經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)應(yīng)用于PIK3CA基因9號(hào)外顯子G1633A(E545K)基因突變的檢測(cè)。最后分析PIK3CA基因的熱點(diǎn)突變與乳腺癌之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：重組的突變和野生質(zhì)粒定量后，將突變模板和野生模板分別稀釋成109、108、107、106、105、104拷貝/μl濃度梯度作為模板，檢驗(yàn)硫化修飾引物與高保真酶的靈敏度和特異性。結(jié)果顯示分子開

5、關(guān)技術(shù)在模板濃度小于106拷貝/μl時(shí)高保真酶及硫化修飾引物具有較好的靈敏度和特異性，分子開關(guān)技術(shù)的反應(yīng)體系可用于濃度為104-105拷貝/μl的乳腺癌及乳腺纖維腺瘤和癌旁乳腺組織的基因組DNA樣本的突變檢測(cè)。PCR突變檢測(cè)結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果一致，證明分子開關(guān)技術(shù)可用于體細(xì)胞基因突變的檢測(cè)。
　　 利用高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)技術(shù)在90例乳腺癌患者組織DNA中檢測(cè)到了PIK3CA基因突變18例（突變率20％）

6、。18例PIK3CA基因突變中包含A3140G(H1047R)突變14例（突變率15.6%）、G1633A(E545K)突變3例（突變率3.3%）、G1624A(E542K)突變2例（突變率2.2%），其中1例A3140G突變和1例G1624A突變發(fā)生在同一患者中。PIK3CA基因突變與患者的c-erbB-2陰性相關(guān)，而與年齡分布、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)及ER、PR和EGFR是否表達(dá)無(wú)相關(guān)性。乳腺纖維腺瘤和癌旁乳腺組織中未檢測(cè)到PIK3C