探針熔解曲線分析技術用于PIK3CA基因突變檢測.pdf

1、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-Kinase,P13K)是細胞信號通路中一大類脂激酶家族,P13K/AKT信號通路的活化在很多類型的腫瘤中都會導致異常的細胞增生。PIK3CA基因編碼ⅠA類P13K催化亞基p100α,研究發(fā)現(xiàn)它在多種人類腫瘤中發(fā)生功能性突變,導致P13K激酶活性增加,進而導致整個信號通路活化,因此PIK3CA基因突變被認為在腫瘤治療中有預測預后功能,并可以作為藥物開發(fā)的靶點。隨著越來越多P

2、13K信號通路靶向抑制劑的開發(fā),對于PIK3CA基因突變的檢測變得越來越重要。本研究利用分子生物學的方法,基于實時PCR平臺建立檢測體系檢測PIK3CA基因外顯子9及外顯子20上的突變,為PIK3CA基因突變的檢測提供新策略。
　　 第一章,首先介紹了P13K/AKT信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,隨后介紹了PIK3CA基因以及其突變的分子生物學意義和臨床意義,最后介紹了PIK3CA基因突變的檢測方法并提出了本研究所開發(fā)的兩種新

3、策略。
　　 第二章,介紹了改良分子信標探針熔解曲線分析方法的建立,該方法相較于直接測序法提高了突變檢測靈敏度,對于PIK3CA基因突變的檢測較全面,且具有快速,簡便,易于實現(xiàn)高通量檢測的特點,并且避免了22q11.2同源基因(98％)的擴增使得檢測更準確。本檢測體系對于突變DNA的選擇性可達55～10％,靈敏度可達30拷貝/反應,體系特異性及重復性良好。在對122份腫瘤組織標本檢測中結直腸癌標本檢出突變8份(8/94.8.5％

4、),乳腺癌標本檢出突變11份(11/28,39.3％),測序驗證中除3份突變標本測序為野生外其余均與測序結果一致,說明本檢測方法較測序更為靈敏。
　　 第三章,針對3個熱點突變建立單管多重ARMS探針熔解曲線分析方法,該方法的特異性.ARMS引物對突變起到富集作用,提高了野生背景下的突變檢測靈敏度,與前章所介紹的方法相互補充,相互驗證。本體系對于突變DNA的選擇性可達0.5％,靈敏度可達30拷貝/反應,體系特異性及重復性良好。在