應用高分辨率熔解曲線分析技術快速、準確檢測TMPRSS6基因突變.pdf

1、背景與目的:鐵是人體內含量最豐富的一種必需元素,存在于所有細胞內。在體內除主要參與血紅蛋白的合成和氧的輸送外,還參與體內的一些生物化學的過程,包括線粒體的電子傳遞、兒茶酚胺代謝及DNA的合成。此外,參加三羧酸循環(huán)的酶和輔酶約半數(shù)含有鐵或需要鐵的存在。因此,鐵代謝平衡被破壞會造成人體多方面功能的紊亂。人體內鐵的含量在正常情況下維持在一個狹窄的范圍內,鐵缺乏和鐵過載均會引起相對應的疾病。鐵缺乏可以引起缺鐵性貧血和兒童神經(jīng)系統(tǒng)的疾病,鐵過載可

2、以引起血色病。鐵缺乏在全球范圍內超過5億入,導致最常見的疾病為缺鐵性貧血。缺鐵性貧血中有一種類型被稱為鐵不應性缺鐵性貧血(iron-refractory iron deficiency anemia,IRIDA),患者特點為先天性小細胞低色素性貧血,平均血紅細胞體積低,血清鐵和鐵傳遞蛋白飽和度低,經(jīng)口服鐵劑以后血液學指標沒有改善,但靜脈注射的鐵劑治療有部分效果。有學者發(fā)現(xiàn)此病是一種常染色體隱性遺傳病,是患者跨膜絲氨酸蛋白酶6(Trans

3、membranescrine protease6,TMPRSS6或稱Matriptase-2)基因突變導致血清中鐵調素(hepcidin,或稱肝抗菌肽)含量增高所致。
　　 跨膜絲氨酸蛋白酶6是一種Ⅱ型細胞膜絲氨酸蛋白酶,最早在2005年被克隆并且定位。有學者認為跨膜絲氨酸蛋白酶6與人體鐵代謝平衡密切相關。
　　 跨膜絲氨酸蛋白酶6通過控制體內鐵調素的水平來調節(jié)體內鐵的代謝平衡。鐵調素是肝臟內產(chǎn)生的一種荷爾蒙,能夠調節(jié)消

4、化道內鐵的吸收和巨噬細胞內鐵的釋放。鐵調素與細胞膜鐵釋放通道蛋白結合,使其內化并且在溶酶體內被水解,從而阻止消化道細胞和巨噬細胞內鐵釋放到血清中。人體內鐵調素表達增高可以使血清鐵含量下降,導致缺鐵性貧血；鐵調素表達降低則可以使血清鐵含量增高,導致體內鐵過載。
　　 編碼跨膜絲氨酸蛋白酶6的TMPRSS6基因是位于22號染色體長臂1區(qū)2帶的基因。TMPRSS6基因突變導致鐵不應性缺鐵性貧血的病例在2008年被報道。迄今為止,國外已

5、經(jīng)有很多TMPRSS6基因突變導致鐵不應性缺鐵性貧血的報道。同時,一些學者認為TMPRSS6基因與鐵過載也有聯(lián)系。中國人群與其他民族人群遺傳背景存在差異,中國人TMPRSS6基因突變的與其他民族之間也可能存在差異。根據(jù)PubMed等文獻檢索數(shù)據(jù)庫的檢索結果,未見有關中國人群TMPRSS6基因突變導致缺鐵性貧血的報道。據(jù)研究,我國兒童鐵元素缺乏的病例所占比例較高。
　　 高分辨率熔解曲線分析(High-resolution mel

6、ting,HRM)技術是一種基于PCR的突變檢測方法,該方法通過檢測DNA雙鏈序列之間的解鏈差異來判斷序列之間的差異。雙鏈DNA分子的解鏈受一些因素的影響,包括:片段長度、序列的GC含量和GC分布等。當片段在一定條件下,單個堿基的變化對片段的解鏈溫度有影響,通過高分辨率和靈敏度的檢測技術可以檢測出來。一個純合子樣品經(jīng)過PCR擴增之后得到的是同源雙鏈,G:C和A:T之間單個堿基的變化的純合突變對片段的解鏈溫度有影響。雜合子樣品經(jīng)過PCR變

7、性、復性之后,其組分包含四種雙鏈分子:兩種同源雙鏈、兩種異源雙鏈。PCR之后,PCR產(chǎn)物結合上了染料,開始升溫之前PCR的熒光強度很高。逐漸升高溫度,隨著溫度的升高,DNA雙鏈逐漸解開,結合上的染料被釋放,熒光值逐漸減少,得到熒光強度隨著溫度的升高而變化的曲線,即熔解曲線。當片段一定的情況下,單個堿基的差異能反映在解鏈溫度上,表現(xiàn)在熔解曲線的差異。它是一種低成本、高通量、快速、高靈敏度的檢測基因突變的方法。
　　 本研究主要是通

8、過定點誘變技術與基因克隆技術來構建TMPRSS6基因的已知突變,并針對TMPRSS6基因的所有外顯子及剪接位點來設計高分辨率熔解曲線分析檢測方法,并用該檢測方法篩檢中國人群中缺鐵性貧血病例以期找到中國人TMPRSS6基因的相關數(shù)據(jù)。
　　 本研究旨在為進一步闡明中國人鐵不應性缺鐵性貧血的分子機制,為臨床上該類疾病的診斷、預防和治療提供參考,同時也為TMPRSS6基因突變導致的其他鐵代謝異常疾病的分子機制的研究提供借鑒。
　

9、　 材料與方法
　　 1.標本:共收集145例缺鐵性貧血病例(男性41例、女性104例；年齡:18.3±14.9歲)的血清及對應的全血標本。采用標準的飽和酚/氯仿法從外周血中提取基因組DNA。
　　 2.血液學分析:血常規(guī)、血紅蛋白含量分析、鐵參數(shù)指標分析由珠海市婦幼保健醫(yī)院完成。用“人鐵調素hepcidin酶聯(lián)免疫分析”試劑盒檢測血清標本中鐵調素(hepcidin)含量。
　　 3.分子分析方法
　　

10、 (1)針對國外人群報道的與缺鐵性貧血有關的TMPRSS6基因突變采用大引物PCR方法定點誘變和基因克隆方法:首先通過設計定點誘變引物,采用PCR技術直接從人基因組DNA樣品中獲取目的基因——含某一突變的基因,然后運用經(jīng)典的基因工程技術將其克隆至pTA2-T載體,轉化的宿主菌為大腸桿菌DH5α。每個克隆重組子中插入的目的基因進行DNA測序以驗證基因突變型。
　　 (2)針對TMPRSS6基因的所有外顯子及剪接位點設計高分辨率熔解

11、曲線分析的引物,構建TMPRSS6基因的高分辨率熔解曲線分析方法。
　　 4.統(tǒng)計學分析:用建立的TMPRSS6基因高分辨率熔解曲線分析方法對構建的包含TMPRSS6基因已知突變的人工突變體進行穩(wěn)定性分析,采用統(tǒng)計學分析方法,以確定該方法的穩(wěn)定性與可靠性。使用的統(tǒng)計學分析軟件為SPSS13.0。
　　 5.標本篩檢:對所收集的缺鐵性貧血標本進行TMPRSS6基因突變篩查。
　　 6.實驗結果的綜合分析、總結。

12、r>　　 結果:運用大引物PCR定點誘變方法人工構建包含TMPRSS6基因已知突變的突變體,并將誘變得到的片段克隆到pTA2 T-載體后進行測序,所有克隆均鑒定為所需突變,誘變成功率100％。
　　 建立的針對TMPRSS6基因的高分辨率熔解曲線分析方法能夠快速、準確地區(qū)分已知突變序列和野生型序列。
　　 收集145例缺鐵性貧血標本,對其進行血液學分析、檢測血清鐵調素(hepcidin)含量,共篩選出26例鐵調素表達水

13、平高的標本,對這26例標本進行TMPRSS6基因的高分辨率熔解曲線分析檢測,未發(fā)現(xiàn)已知突變,亦未發(fā)現(xiàn)新突變,只檢測到3個已知的單核苷酸多態(tài)性(single nuclemide polymorphism,SNP)。
　　 結論:人類營養(yǎng)不良主要以微量元素缺乏為主。人體內鐵元素缺乏是當今世界最流行的營養(yǎng)性問題之一,缺鐵性貧血是全世界發(fā)病率最高的營養(yǎng)性疾病之一。由于體內鐵元素不平衡導致的疾病正日益受到關注。
　　 高分辨率熔解

14、曲線分析技術是近幾年來興起的基因突變檢測技術。這種檢測方法不受突變堿基位點與類型的局限,無需序列特異性探針,在PCR結束后直接運行高分辨率熔解檢測,即可完成對樣品基因型的分析。這種方法因其操作簡便、快速,使用成本低,結果準確,并且實現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關注。
　　 本課題研究中建立的針對TMPRSS6基因的高分辨率熔解曲線分析檢測方法能夠快速、準確地將TMPRSS6基因突變序列與野生型序列區(qū)分,并且實驗的重復性和再現(xiàn)性

15、好、穩(wěn)定性高,方法可靠。本研究建立的基于PCR的高分辨率熔解曲線分析TMPRSS6基因突變診斷方法是一種高通量、高靈敏度、自動化、快速、準確、經(jīng)濟的突變檢測技術。
　　 近年來,TMPRSS6基因突變導致鐵不應性缺鐵性貧血的病例不斷被報道,但并沒有對TMPRSS6基因進行人群突變篩查的研究。本研究中,利用高分辨率熔解曲線分析技術對中國人缺鐵性貧血病例標本進行突變篩查,沒有發(fā)現(xiàn)已知突變,這也說明了中國人TMPRSS6基因突變的攜帶

16、率相對較低。
　　 目前,國內對缺鐵性貧血的病因分析主要認為是鐵攝入的量過少或鐵丟失的量過多造成的,較少涉及到遺傳學病因的分析。根據(jù)PubMed等文獻檢索數(shù)據(jù)庫的檢索結果,未見有關中國人群TMPRSS6基因突變導致缺鐵性貧血的報道。因此對缺鐵性貧血的遺傳學病因的研究具有重要的意義和價值。
　　 本研究為TMPRSS6基因的檢測建立了一種簡便、經(jīng)濟、快速、高效和靈敏的檢測方法,這為TMPRSS6基因突變導致的一類疾病的基因