突變富集高分辨率熔解曲線分析技術體系的建立以及在循環(huán)外周血檢測中的運用.pdf

1、許多研究已經證實，腫瘤患者循環(huán)外周血DNA與腫瘤組織DNA的突變具有一致性，又因為血液樣本留取方便，可隨時進行動態(tài)檢測，因此循環(huán)外周血成為腫瘤突變檢測較佳的替代的樣本，而在循環(huán)外周血中實現(xiàn)腫瘤相關基因的檢測也越來越成為技術研發(fā)人員所關注的熱點。許多針對外周血檢測的方法應運而生，但實際檢測結果卻差強人意。循環(huán)血中DNA總量偏低，且存在大量正常組織DNA的混雜，個體差異、腫瘤發(fā)生發(fā)展時期、治療時期造成循環(huán)DNA的總量不定使得檢測循環(huán)外周血基

2、因的技術手段要求不需要依賴DNA濃度的判斷，無需聚類對比，具備高特異性以及超高的檢測靈敏度。現(xiàn)階段還沒有一種商業(yè)化的快速、簡便的高靈敏度檢測方案能夠擺脫以上檢測條件的限制，實現(xiàn)在外周血腫瘤標志基因的檢測，這方面的研究工作還需要進一步探索。
　　高分辨率熔解曲線分析技術(high resolution melting analysis，HRM)利用不同長度或不同堿基組成的DNA序列熔解曲線不同的原理，在PCR后直接運行高分辨熔解就可

3、完成對樣品突變分析。HRM技術作為一種閉管檢測、簡便快速、靈敏度高、重復性好、準確性高、可實現(xiàn)高通量檢測的一種分型篩查方式，在臨床推廣上有著無可比擬的優(yōu)越性。但是傳統(tǒng)的HRM技術除了其技術本身存在的缺陷，還存在著對操作均一性要求較高，檢測靈敏度、穩(wěn)定性不高等問題，這些使得HRM技術的運用推廣受到很大的限制。本實驗旨在運用更高精度的HRM技術，并增加其靈敏度，降低判別難度，使其在臨床運用上得到更好的運用。
　　本實驗發(fā)明了一種新的富

4、集擴增的技術—Snapback primer ARMS（SP-ARMS），獲得了近1000倍的富集效率，并將此新的高效富集擴增技術與HRM技術相結合，實現(xiàn)了萬分之一甚至更高的檢測靈敏度，滿足了臨床上對突變檢測技術不易污染、靈敏性高、特異性強、簡便易行、結果易判定的要求。隨后我們將此技術成功運用于非小細胞肺癌患者組織和血漿樣本EGFR/KRAS基因檢測中，與組織測序和ADx-EGRR/KRAS檢測試劑盒檢測相比，具有更高的靈敏度和準確性。

5、
　　第一部分:彈回探針突變富集擴增技術(Snapback primer ARMS，SP-ARMS)的發(fā)明和彈回探針突變富集擴增高分辨率熔解曲線分析技術(SPA-HRM)體系的建立
　　目的：發(fā)明彈回探針突變富集擴增技術，實現(xiàn)對突變型模板高效率的富集擴增，達到對低頻體細胞突變基因的檢測的要求，且能與HRM技術進行無間斷銜接，以實現(xiàn)一步化基因檢測。方法：通過檢測EGFR、KRAS基因突變建立彈回探針高分辨率熔解曲線分析技術檢測

6、體系，在47例具有測序結果的非小細胞肺癌患者組織中進行檢測體系特異性的驗證。在此基礎上發(fā)明彈回探針突變富集擴增技術(SP-ARMS)，將突變型與野生型模板按照不同比例混合，經過普通PCR和SP-ARMS技術的富集擴增后，使用測序技術檢測該技術的富集效率。之后結合彈回探針HRM檢測，建立一步快速彈回探針突變富集擴增高分辨率熔解曲線分析技術(SPA-HRM)體系，并檢測其靈敏度。結果：經過組織測序鑒定，EGFR基因19號外顯子缺失突變經SP

7、-ARMS技術的富集擴增后，測序可以達到萬分之一的靈敏度;L858R點突變和KRAS基因點突變經SP-ARMS技術的富集擴增后，可以檢測到百分之一的突變。SPA-HRM檢測系統(tǒng)在此基礎上又將靈敏度提高了10倍。結論：本實驗發(fā)明了一種富集擴增的技術—Snapback primer ARMS，獲得了高達1000倍的富集效率，是一項高效、簡單易行、不需要提高任何檢測成本的高效富集擴增方法，隨之與Snapback primer HRM技術的結合

8、，實現(xiàn)了千分之一到萬分之一甚至更高的檢測靈敏度。
　　第二部分:在組織、循環(huán)外周血中運用彈回探針突變富集擴增高分辨率熔解曲線分析技術進行EGFR、KRAS基因突變的檢測
　　目的：在非小細胞肺癌(NSCLC)患者組織、循環(huán)外周血中運用SPA-HRM技術進行相關突變檢測，與組織測序、ADX-EGFR/KRAS基因檢測試劑盒相比，檢測系統(tǒng)的準確性。方法：收集NSCLC患者肺癌組織樣本150例、其中有85例循環(huán)外周血樣本與之相對應

9、。通過引物探針的設計進行EGFR基因exon19缺失突變、exon21 L858R點突變和KRAS基因2號外顯子第12、13密碼子常見突變的檢測。進行基因組DNA的抽提后，使用SPA-HRM技術檢測的同時，使用測序技術和ADX-EGFR、KRAS基因試劑盒進行雙盲檢測，鑒定該檢測技術的穩(wěn)定性、準確性;探論血漿與血清樣本對檢測結果的影響，選擇合適的樣本量和樣本抽提方式。結果：在85例的NSCLC患者血液樣本及相對應的組織樣本檢測中，測序法