水稻白葉枯病抗性突變體的篩選與高分辨率溶解曲線在水稻中的應用.pdf

1、水稻白葉枯病是水稻重要病害之一,對水稻生產造成了嚴重的危害。新的白葉枯病抗性種質資源的獲得對于水稻抗白葉枯病育種具有重要意義。
　　 本研究對5萬個T-DNA突變體株系進行了系統(tǒng)的大田篩選。從5葉期開始,每個株系經過4輪的白葉枯病菌P10接種,研究初篩獲得了一些白葉枯病抗性植株,對其中2個表型較好的植株進行了初步的生理研究。同時,在突變體庫中觀察獲得了一些其他表型突變的株系。為加快水稻突變體基因定位,本研究嘗試利用高分辨率溶解曲

2、線技術(high resolution melting,HRM)進行水稻F2群體基因分型,為后期將HRM用于突變體中抗性基因定位探索條件。目前,已取得的主要研究結果有:
　　 1.通過T-DNA突變體庫大田種植觀察及接種P10菌株,初篩獲得了125個M0代白葉枯病抗性突變體。同時,獲得了一些具有其他表型變化的突變體株系,如類病變突變體,葉色突變體,穎花退化,穗頸長度變化,有芒與無芒,穎殼變化,高矮稈突變,葉形突變等。
　　

3、 2.對初篩獲得的125個M0代白葉枯病抗性突變體中的17個株系的M1代進行了對P10菌株的抗性鑒定,結果表明2個株系BBM14和BBM66的M1代對P10菌株抗性穩(wěn)定,且BBM14和BBM66的M1代植株無明顯抗性分離。同時,轉基因PCR檢測表明T-DNA插入已經純合,因此,需要設計專門實驗來判斷BBM14和BBM66的抗性是否由T-DNA插入引起。對接種P10后葉片內部的菌株生長情況進行生長曲線分析表明,P10菌株在BBM14和B

4、BM66中的生長相對于親本中花11明顯受到抑制,由此進一步證實了BBM14和BBM66對P10菌株的抗性。對BBM14和BBM66的抗譜分析發(fā)現,BBM14對白葉枯病菌株菲律賓生理小種P2(PXO86),P3(PXO79),P7(PXO145),P8(PXO280),P10(PXO124)表現抗性,對P4(PXO71),P6(PXO99)表現感病。BBM66對P2,P7,P8,P10菌株表現出抗性,對P3,P4,P6表現感病。同時,將B

5、BM14和BBM66抗譜與已知白葉枯病抗性基因抗譜比較后發(fā)現,兩者的抗譜與這些白葉枯病抗性基因抗譜都不同,因此,初步判斷BBM14和BBM66中均具有新的白葉枯病抗性基因。對BBM14和BBM66中的部分防衛(wèi)相關基因進行表達分析,結果表明接種P10菌株后OsPR16基因表達上調。
　　 3.本研究嘗試將HRM用于水稻F2群體基因分型,同時進行了HRM反應條件優(yōu)化,為后續(xù)將HRM用于BBM14和BBM66中抗性基因定位打下了基礎。

6、利用本實驗室創(chuàng)制的高抗白葉枯病材料Y73以及高感白葉枯病材料IR24雜交以構建F2群體,選取了22株F2植株。在5μl反應體系及普通PCR程序條件下,本研究對353對STS和SSR分子標記進行了Y73,IR24以及其F1之間多態(tài)HRM分子標記篩選,其中103對分子標記表現出多態(tài)的HRM曲線。將這103對多態(tài)HRM分子標記用于以上F2群體的HRM基因分型,結果顯示在5μl反應體系及普通PCR程序條件下,12對STS和SSR分子標記成功地對

7、該F2群體進行了基因型分析。傳統(tǒng)的凝膠電泳結果顯示,HRM基因分型結果與傳統(tǒng)的PCR后電泳檢測結果完全一致。為提高STS與SSR分子標記用于HRM基因分型的效率,本研究在另外兩種HRM反應條件下,對這103對多態(tài)HRM分子標記用于該F2群體基因分型進行了重新的篩選。在5μl反應體系與降落PCR程序中,篩選效率沒有明顯提高,而在10 μl反應體系與降落PCR程序中,除了這12對分子標記外,另外9對分子標記成功地對該F2群體進行了基因分型,

8、篩選效率明顯提高。因此,以上結果表明HRM用于水稻F2群體的基因分型具有可行性,且3種HRM體系中,10 μl反應體系與降落PCR程序條件時的HRM體系更穩(wěn)定,更適宜于水稻F2群體基因分型。
　　 綜合以上研究結果表明,突變體BBM14和BBM66對部分白葉枯病菌抗性穩(wěn)定,可進行進一步的白葉枯病抗性基因研究。同時,HRM技術在水稻F2群體基因分型中具有可行性,因此,將HRM技術應用于BBM14和BBM66相關抗性基因的研究對于同