高分辨率溶解曲線(HRM)技術(shù)在高血壓患者MTHFR基因多態(tài)性篩查中的應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　H型高血壓為伴有高同型半胱氨酸血癥(homocysteine，Hcy)的原發(fā)性高血壓，近年來越來越受到人們的重視，它以血Hcy水平增高為特點（Hcy≥10μmol/L），是動脈粥樣硬化的獨立危險因素，與外周血管病變、腦血管病變、高血壓、高血壓性心臟病、冠狀動脈阻塞及血栓形成的發(fā)生密切相關(guān)。
　　人類亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝

2、中的關(guān)鍵酶之一，可將還原型輔酶Ⅰ(NADPH)相關(guān)的5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，這一代謝途徑的正常運轉(zhuǎn)在維持血漿中同型半胱氨酸正常水平中至關(guān)重要。MTHFR常見的突變?yōu)?77位堿基C被T置換，產(chǎn)生Ala222 Val錯義突變，這一突變位于葉酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。MTHFR的C667T錯義突變，可降低血液中5-甲基四氫葉酸水平和升高Hcy水平，從而干擾DNA合成和損傷修復(fù)，引發(fā)包括H型高血壓在內(nèi)的多種疾病。因此，本課題組開展的

3、在高血壓患者中篩查MTHFR基因多態(tài)性十分必要，但是現(xiàn)有臨床使用的SNP位點檢測，常為一代測序，耗時長，成本高，已經(jīng)滿足不了臨床檢測的需要，也不適合大規(guī)模用于MTHFR C667T的流行病學調(diào)查研究。
　　高分辨率溶解曲線分析技術(shù)(High Resolution Melting, HRM)是結(jié)合飽和熒光染料、未標記探針和實時熒光定量PCR的一種新的檢測基因突變與基因分型的分子診斷技術(shù)，具有高通量、低成本、簡單快捷、準確、靈敏度和特

4、異性高和真正閉管操作等優(yōu)點。其次，傳統(tǒng)DNA樣本往往從血液中抽提DNA，即收集病人的血樣標本，這種方法有幾個明顯的缺點:需要具備醫(yī)務(wù)人員及一定的采血設(shè)備;抽血的疼痛造成排斥拒絕采樣;侵入性采集增加了感染的可能性;采集后血樣必須低溫運輸保存。而從唾液中抽提DNA可以避免以上缺點，可提供無疼痛、非侵入性的方法，無需忍受抽血的疼痛和感染的風險，即可獲得高質(zhì)量、高數(shù)量的樣品，受測者排斥性低，嬰兒和老人都能方便地獲得DNA樣本。
　　因此，

5、本課題旨在將唾液抽提DNA和HRM技術(shù)結(jié)合起來，建立一種快速檢測MTHFR基因C677T多態(tài)性的方法。
　　方法:
　　收集2014年1月-2014年7月在我院心血管內(nèi)科門診治療的500例高血壓患者，再從我院體檢中心選取500例健康人員為健康對照組，每人收集唾液2mL及全血200ul，使用昌美生物的Just-a-TubeTM唾液DNA提純試劑盒提取唾液DNA，使用上海凡濟生物科技有限公司的全血DNA抽提試劑盒提取全血NDA，

6、測定兩者抽提DNA的OD260/280比值并比較，評估從唾液抽提DNA用于后續(xù)HRM法的可行性。
　　根據(jù)Genbank上MTHFR的基因序列，采用引物設(shè)計軟件Primer5設(shè)計MTHFR SNP位點c.677C＞T的特異性引物以及測序引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，直接應(yīng)用Bio-Rad CFX Manager進行PCR擴增以及HRM分析。并將擴增產(chǎn)物進行測序，比較兩種方法的靈敏度和特異性。
　　采用EDTA抗凝管收集患者空腹靜脈血4

7、ml，測定血Hcy和葉酸水平，高血壓患者根據(jù)MTHFR C667T不同基因型分為CC、CT、TT型，比較三組之間Hcy和葉酸水平，初步探討MTHFR C667T基因多態(tài)性對Hcy水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1)唾液和血液DNA濃度比較:我們用武漢昌美生物技術(shù)有限公司的唾液抽提DNA試劑盒提取了500份高血壓患者和500份正常對照組的唾液樣本，抽提的DNA均檢測了OD260/280的比值，結(jié)果顯示，平均OD260/280為1

8、.809(95％CI1.791-1.827)。采用上海凡濟生物科技有限公司的全血DNA抽提試劑盒提取了500份高血壓患者和500份正常對照組的全血標本，平均OD260/280為1.823，95％CI1.720-1.854。唾液抽提出的DNA純度與全血抽提的DNA結(jié)果純度相近。
　　2)成功構(gòu)建一種快速檢測MTHFR基因C677T多態(tài)性的HRM法:HRM法引物:Forward primer, TGAGGCTGACCTGAAGCA,

9、Reverse primer,TGTCAGCCTCAAAGAAAA。20μl反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)體系為:引物濃度0.8μmol/L，2×Eva Green premix10μl，DNA5 ng，雙蒸水4.2μl。設(shè)定程序為兩步法Real-Time PCR:預(yù)變性95℃，1分鐘;之后每一步變性95℃，5S;退火延伸60℃，20 S;共進行40個循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。HRM分析條件:PCR結(jié)束后從65℃開始到95℃，循環(huán)上升0.2℃

10、，維持20 S，并檢測熒光。
　　3)MTHFR C667T HRM法檢測結(jié)果與測序結(jié)果比較:1000例受試者用本研究建立的HRM法檢測出270例(27.0％)CC型，425例(42.5％)CT型和305例(30.5％)TT型。1000例樣本再用測序檢測，結(jié)果提示，268例(26.8％) CC型，426(42.6％)CT型和306例(30.6％)TT型。HRM法有兩例檢測結(jié)果與測序結(jié)果不符，準確率為99.8％。
　　4)不同

11、分型的高血壓患者血漿Hcy和葉酸水平比較:MTHFR C667T根據(jù)不同基因型分為CC、CT和TT型，TT型高血壓患者血漿Hcy水平明顯高于CC型和CT型(P＜0.01)，葉酸水平，CT和TT型顯著低于CC型(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:
　　1 本研究將無創(chuàng)的唾液抽提DNA法應(yīng)用于HRM前的DNA抽提純化，并證實了其可行性，減輕患者采血取樣的痛苦;
　　2 通過測序技術(shù)對HRM篩查結(jié)果的驗證，初步證實了HRM技術(shù)