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文檔簡介
1、【目的】探討人角膜緣微環(huán)境細(xì)胞(LNCs)是否表達(dá)干細(xì)胞因子(SCF)及SCF在LNC細(xì)胞增殖過程中的作用。
【方法】采用組織切片免疫熒光染色檢測人角膜緣組織中SCF及其受體C-kit的表達(dá)情況,其中以波形蛋白(vimentin)和pan cytokeratin(PCK)來區(qū)別基質(zhì)及上皮組織。從人的角膜緣組織中分離培養(yǎng)人角膜緣微環(huán)境細(xì)胞(LNC),以人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)為對照,采用流式細(xì)胞技術(shù)和熒光定量實(shí)時
2、PCR技術(shù)檢測其CD90,CD105,CD73及SCF表達(dá)情況;采用免疫印跡技術(shù)檢測SCF的表達(dá)量;采用免疫熒光技術(shù)檢測SCF的表達(dá)部位。利用攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的hSCF siRNA慢病毒載體,以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)0,5,10,15,20,30,50感染LNC,熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況,確定最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)值。以最佳感染復(fù)數(shù),采用攜帶GFP的慢病毒感染LNC做SCFsiRNA實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組,分別為:LNC空
3、白組(CON組)、慢病毒感染LNC陰性對照組(NC組)、慢病毒感染LNC SCF siRNA組。采用熒光定量實(shí)時PCR(real-time PCR)和免疫印跡技術(shù)檢測 SCF siRNA的沉默效率。并采用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測各組LNC增殖活性變化。
【結(jié)果】人角膜緣組織切片免疫熒光染色結(jié)果顯示:SCF主要表達(dá)于PCK陽性細(xì)胞的基底層,其受體C-kit主要位于角膜緣組織的上皮層,而非基
4、底層。流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示:96.73%的LNC表達(dá)CD90,88.71%的LNC表達(dá)CD105,95.02%的LNC表達(dá)CD73,11.06%的LNC表達(dá)SCF;而98.61%的BMMSC表達(dá)CD90,92.31%的BMMSC表達(dá)CD105,98.09%的BMMSC表達(dá)CD73,3.14%的BMMSC表達(dá) SCF。熒光定量實(shí)時PCR結(jié)果從mRNA水平顯示:LNC和BMMSC細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CD90,CD73,CD105和SCF的含量無明顯差
5、異,而LNC細(xì)胞中vimentin,SOX2和POU5F的mRNA含量明顯高于BMMSC細(xì)胞。免疫印跡結(jié)果表明:LNC細(xì)胞中SCF的含量高于BMMSC。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SCF主要表達(dá)于LNC和BMMSC的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。攜帶綠色熒光蛋白(GFP)和hSCF siRNA的慢病毒,以不同感染復(fù)數(shù)感染LNC后,除MOI=0外其余MOI值條件下感染72h后LNC均有綠色熒光表達(dá),但以MOI=5條件下LNC細(xì)胞生存狀態(tài)良好,且隨培養(yǎng)時間延長1
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