角膜緣干細(xì)胞自體移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：在眼表干細(xì)胞損傷疾病的治療中，角膜緣干細(xì)胞移植(limbal stem celltransplantanion，LSCT)已經(jīng)被確定為修補(bǔ)角膜緣組織缺損，補(bǔ)充角膜緣干細(xì)胞種群，治療角膜緣干細(xì)胞缺損(limbal stem cell deficiency，LSCD)和重建眼表結(jié)構(gòu)極為有效的方法。自體角膜緣干細(xì)胞移植(autograft)不存在免疫排斥反應(yīng)，移植成活率高。對(duì)于單眼部分干細(xì)胞缺損的患者，從健康眼表取多大范圍的角膜緣

2、干細(xì)胞組織才能保證其自然愈合不受損傷，仍然是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。纖維蛋白粘合劑(fibrin sealant，F(xiàn)S)作為一種新型的生物材料，已經(jīng)證明有止血和粘合組織的作用，無(wú)毒、無(wú)致癌、無(wú)致突變和致畸形作用，具有良好的生物相容性及生物降解性，不易引起炎癥、異物反應(yīng)、組織壞死等，在眼科手術(shù)中也有廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)首先連續(xù)遞增地切除不同范圍兔眼角膜緣干細(xì)胞組織，通過(guò)眼表裂隙燈顯微鏡觀察，角膜上皮印跡細(xì)胞學(xué)觀察及組織病理學(xué)觀察，確定角膜緣

3、干細(xì)胞移植時(shí)健眼取材的安全范圍。并且通過(guò)角膜組織病理、透射電鏡觀察和免疫組化方法探討FS行無(wú)縫線角膜緣干細(xì)胞移植治療LSCD的可行性，為臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1．按30°、60°、90°等依次遞增至210°，分組切除兔眼角膜緣干細(xì)胞組織建立模型。 2．通過(guò)裂隙燈顯微鏡觀察各組角膜混濁、上皮熒光染色及角膜新生血管3項(xiàng)臨床指標(biāo)，角膜上皮印跡細(xì)胞學(xué)檢查及HE染色觀察角膜上皮的細(xì)胞表型和組織病理學(xué)變化，確定角膜

4、緣干細(xì)胞健眼取材的安全范圍。 3．建立兔眼角膜緣干細(xì)胞部分缺損模型，并隨機(jī)分為纖維蛋白粘合劑組和常規(guī)縫線組對(duì)兔眼行白體角膜緣干細(xì)胞移植。手術(shù)三天后每天行角膜熒光素染色觀察兩組兔眼角膜上皮愈合時(shí)間；術(shù)后7天、14天、30天通過(guò)裂隙燈顯微鏡觀察角膜混濁和新生血管生長(zhǎng)情況。 4．術(shù)后14、30天裂隙燈顯微鏡觀察兩組兔供眼角膜混濁、上皮熒光素染色及角膜新生血管情況。 5．通過(guò)HE染色光鏡觀察術(shù)后7天、14天、30天三個(gè)時(shí)

5、間點(diǎn)FS組和縫線組兔眼角膜組織病理變化。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法觀察兩組角膜上皮特異性角蛋白K3以及P63蛋白的表達(dá)。移植術(shù)后30天，透射電鏡觀察角膜的超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果： 1．兔眼角膜緣切除范圍大于150°時(shí)，角膜出現(xiàn)混濁、上皮持續(xù)缺損、新生血管長(zhǎng)入及結(jié)膜上皮向角膜內(nèi)生長(zhǎng)等干細(xì)胞失代償表現(xiàn)，臨床指標(biāo)評(píng)分比較有顯著差異(P=0.000<0.01)。 2．在出現(xiàn)角膜緣干細(xì)胞失代償?shù)耐醚劢悄ど掀び≯E細(xì)胞學(xué)檢查中，可見(jiàn)P

6、AS染色陽(yáng)性的結(jié)膜杯狀細(xì)胞。 3．FS組角膜上皮愈合時(shí)間比縫線組短(P=0.044<0.05)，F(xiàn)S組在刺激角膜新生血管方面明顯輕于縫線組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.043<0.05)。 4．移植術(shù)后7天，F(xiàn)S組和縫線組角蛋白K3表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)，F(xiàn)S組角蛋白K3表達(dá)的10D值高于縫線組(P<0.05)，而術(shù)后30天FS組和縫線組與正常角膜間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 5．術(shù)后7天、14天

7、、30天，F(xiàn)S組與縫線組角膜P63蛋白表達(dá)量明顯增加，與正常兔眼角膜P63蛋白表達(dá)的IOD值比較均有非常顯著的差異(P<0.01)，而FS組與縫線組之間P63蛋白表達(dá)的IOD值未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1．角膜緣干細(xì)胞組織移植健眼的取材范圍≤150°(相當(dāng)于5個(gè)鐘點(diǎn)位)是安全的。角膜緣干細(xì)胞切取范圍>150°可能出現(xiàn)不可逆的角膜緣干細(xì)胞失代償。 2. 纖維蛋白粘合劑行無(wú)縫線自體角膜緣干細(xì)胞組織移植