RA促進腸上皮Caco-2細胞間緊密連接的機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：RA促進腸上皮細胞Caco-2之間的緊密連接
　　目的：明確RA對Caco-2細胞緊密連接的促進作用，篩選RA最佳作用濃度，探索RA信號通路中RARs與TLRs和緊密連接相關蛋白在RA促進Caco-2細胞發(fā)揮屏障功能中的變化。
　　方法：利用電壓電阻儀檢測RA處理后的Caco-2細胞跨上皮電阻(TER)的變化。給予不同RA濃度(0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μ

2、mol/L、20μmol/L)處理Caco-2細胞，Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測分析RA作用后Caco-2細胞中RARs、TLRs和緊密連接相關蛋白的表達水平變化。免疫熒光染色觀察RA作用Caco-2細胞后關鍵受體RARβ的定位表達差異。
　　結(jié)果：RA處理顯著增加Caco-2細胞跨上皮電阻，與未處理組比較具有統(tǒng)計學差異，P＜0.01。不同濃度RA(0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L

3、、10μmol/L、20μmol/L)分別處理Caco-2細胞后，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示RARβ、TLR4和ZO-2的mRNA表達水平均較RA未處理組有明顯升高，且RA為1-10μmol/L時效果最為顯著(P＜0.05，P＜0.001);Western blot進一步分析RARβ、TLR4和ZO-2三個蛋白表達水平變化，其結(jié)果與real-time PCR檢測分析完全一致。但不同濃度 RA對RARα、RARγ和TLR2，以

4、及Occludin、ZO-1的表達水平并沒有明顯的改變。同時，免疫熒光染色觀察到未經(jīng)RA處理的Caco-2細胞中RARβ多定位于細胞核膜周邊;隨著RA作用濃度的不斷升高，發(fā)現(xiàn)RARβ在胞漿中的表達逐漸增加，由核膜周邊聚集的RARβ逐漸移向胞漿。
　　結(jié)論：RA增加Caco-2細胞的跨上皮電阻，促進其緊密連接，其機制可能是通過RARβ信號通路，上調(diào)TLR4和緊密連接蛋白ZO-2的表達水平，從而實現(xiàn)RA促進腸上皮屏障的保護作用。

5、>　　第二部分：RARβ調(diào)節(jié)TLR4促進Caco-2細胞緊密連接蛋白ZO-2的表達
　　目的：利用Ad-RARβ和siRARβ重組腺病毒研究RARβ調(diào)控RA促進Caco-2細胞緊密連接的作用，通過免疫共沉淀(Co-IP)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)探索RARβ、TLR4和ZO-2三者之間的相互作用關系，尋找RARβ促進ZO-2表達的具體調(diào)控機制。
　　方法：重組Ad-RARβ和siRARβ腺病毒分別感染Caco-2細胞后，

6、Real-time PCR和Western blot檢測分析RARβ、TLR4和ZO-2三者的表達水平變化。通過免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)，分別利用RARβ抗體和ZO-2抗體免疫沉淀細胞中與之結(jié)合的蛋白，Western blot檢測發(fā)生免疫共沉淀的目的蛋白。運用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)，通過RARβ抗體沉淀Caco-2細胞中DNA-蛋白交聯(lián)復合物，Real-time PCR檢測分析經(jīng)RARβ抗體富集的DNA序列表達水平的差異。

7、
　　結(jié)果：重組腺病毒Ad-RARβ感染Caco-2細胞后，Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，RARβ mRNA和蛋白表達水平均有明顯升高，較RFP對照組具有顯著性的差異，P＜0.001;同時TLR4和ZO-2的表達水平也隨之顯著性上調(diào);當siRARβ感染阻斷RARβ的表達水平時，Caco-2細胞中TLR4和ZO-2的蛋白表達水平也隨之降低，較RFP對照組相比具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.0

8、1）。Co-IP檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RARβ抗體可沉淀Caco-2細胞中TLR4蛋白，ZO-2抗體可沉淀細胞中TLR4蛋白，表明在Caco-2細胞中RARβ蛋白與TLR4蛋白相互結(jié)合，TLR4蛋白與ZO-2蛋白相互結(jié)合;但RARβ與ZO-2之間沒有蛋白-蛋白間的相互作用。進一步利用ChIP技術(shù)研究表明，RARβ可與胞內(nèi)TLR4啟動子區(qū)相結(jié)合，但與ZO-2啟動子區(qū)不存在相互作用。
　　結(jié)論：利用重組腺病毒分別過表達和沉默RARβ，證實RA