CX3CR1在BM MSCs修復(fù)受損腸上皮細(xì)胞間緊密連接中的作用.pdf

1、目的：在體外成功分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow me senchymal stem cells, BM MSCs）及成功利用腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）刺激結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2建立體外腸黏膜上皮損傷模型的基礎(chǔ)上，探討趨化因子受體CX3CR1在BM MSCs修復(fù)受損腸上皮細(xì)胞間緊密連接中所發(fā)揮的作用。
　　方法：⑴體外貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠BM M

2、SCs至3代，觀察BM MSCs的細(xì)胞形態(tài)、流式檢測細(xì)胞表型、成脂成骨誘導(dǎo)分化方法檢測BM MSCs的分化能力。⑵使用Caco-2模擬腸黏膜上皮細(xì)胞，免疫熒光、RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測緊密連接蛋白ZO-1和Occludin來評價Caco-2的腸道屏障功能。將TNF-α以0 ng/m L、50 ng/mL、100 ng/mL和200ng/mL四種不同濃度處理Caco-2，探索TNF-α作用Caco-2的最佳損傷濃度；

3、選擇造模最佳濃度點作用Caco-2細(xì)胞，作用時間分別為0h、12h、24h和48h，篩選TNF-α作用Caco-2的最佳損傷時間，從而摸索出建立穩(wěn)定腸黏膜上皮損傷模型的最佳條件。⑶將BM MSCs與受損Caco-2通過transwell小室間接共培養(yǎng)，采用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測Caco-2細(xì)胞上ZO-1和Occludin以及BM MSCs上CX3CR1的含量變化。⑷用CX3CR1抗體孵育封閉BM MSCs上CX3

4、CR1受體，將anti-CX3CR1-BM MSCs與受損Caco-2通過Transw ell小室共培養(yǎng)，RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測Caco-2細(xì)胞上ZO-1和Occludin的含量變化，進一步明確CX3CR1在BM MSCs修復(fù)受損腸上皮細(xì)胞間緊密連接中所發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果：①體外成功提取培養(yǎng)BM MSCs。鏡下BM MSCs貼壁成長，呈長梭形，似漩渦或菊花狀排列，具備典型MSCs的形態(tài)特征。流式檢測三代

5、BM MSCs，93.0％的細(xì)胞表達CD90而不表達CD45，97.5%的細(xì)胞表達CD29而不表達CD34，97.0%的細(xì)胞表達RT1A而不表達RT1B，這說明我們提取的原代細(xì)胞培養(yǎng)至三代可以獲得極純的BM MSCs，幾乎沒有造血干細(xì)胞等混雜。將三代BM MSCs使用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)后，油紅O染色細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)橘紅色脂滴，BM MSCs使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)后，Von Kossa染色細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黑色鈣鹽沉積。這些提示我們：采用貼壁篩選法提

6、取的BM MSCs，正是我們需要的目的細(xì)胞。②應(yīng)用不同濃度及不同作用時間的TNF-α處理Caco-2，免疫熒光檢測可見正常Caco-2中ZO-1連接呈蜘蛛網(wǎng)狀，隨著TNF-α濃度的增加、作用時間的延長，ZO-1網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞、熒光強度減弱，RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示隨著TNF-α作用濃度的增大、作用時間的延長，ZO-1、Occludin的表達水平降低越來越明顯，呈濃度依賴和時間依賴，而100 ng/mL和200

7、 ng/mL TNF-α對Caco-2中ZO-1、Occlud in的表達影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，最終證實本實驗條件下TNF-α的最佳造模濃度為100 ng/mL，造模時間為48 h。③BM MSCs與受損Caco-2共培養(yǎng)后，RT-PCR結(jié)果顯示：ZO-1、Occludin mRNA的表達水平較受損Caco-2組增加，同時BM MSCs上CX3CR1 mRNA的表達量較正常BM MSCs組增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義；Western blot結(jié)

8、果顯示：ZO-1、Occludin蛋白的表達水平較受損Caco-2組增加，同時BM MSCs上CX3CR1蛋白的表達量較正常BM MSCs組增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義。mRNA水平與蛋白水平結(jié)果一致。提示：BM MSCs具有修復(fù)受損腸上皮細(xì)胞間緊密連接的作用。④Anti-CX3CR1-BM MSCs與受損Caco-2共培養(yǎng)后，RT-PCR結(jié)果顯示：ZO-1、Occludin mRNA的表達量較阻斷CX3CR1前減少，但高于受損Caco-2組的

9、表達量。Western blot結(jié)果顯示：ZO-1、Occludin蛋白的表達量較阻斷CX3CR1前減少，但高于受損Caco-2組的表達量。揭示了BM MSCs上趨化因子受體CX3CR1參與其修復(fù)受損腸上皮細(xì)胞間緊密連接。
　　結(jié)論：⑴采用貼壁篩選法可以成功提取、培養(yǎng)獲得純度高、數(shù)量多的大鼠BM MSCs，該方法簡單易行。⑵在體外環(huán)境下，使用100 ng/ml TNF-α作用48h刺激Caco-2細(xì)胞，可成功建立穩(wěn)定的腸黏膜上皮損