ERp29基因在腸上皮細(xì)胞輻射損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、腸上皮是實(shí)現(xiàn)腸道消化、免疫、內(nèi)分泌等功能的主要組織細(xì)胞，也是構(gòu)筑腸粘膜屏障的主要成分，在維持機(jī)體生命活動中居重要的地位。電離輻射對小腸上皮細(xì)胞具有毒副作用，一旦遭受損害會引起腸上皮生理功能障礙、機(jī)械屏障作用減弱、腸源性感染嚴(yán)重，還可繼發(fā)多器官功能不全綜合癥甚至引起死亡。研究表明：電離輻射可以誘導(dǎo)多種組織、細(xì)胞的基因及蛋白表達(dá)增強(qiáng)，也可以使另一些基因和蛋白受到抑制，這些基因和蛋白參與了輻射損傷及隨后的修復(fù)反應(yīng)。若能尋找內(nèi)源性有效的輻射損傷

2、修復(fù)基因，就可以顯著減少正常細(xì)胞的輻射損傷。 本課題是在國家自然科學(xué)基金資助下，重點(diǎn)研究電離輻射后ERp29在小腸上皮細(xì)胞中的作用及機(jī)制。課題組前期采用mRNA差異顯示技術(shù)證實(shí)了電離輻射前后基因表達(dá)存在差異，篩選并克隆到幾個輻射誘導(dǎo)表達(dá)基因的EST片斷。在此基礎(chǔ)上，我們采用雙向電泳技術(shù)，比較研究小鼠全身照射前后小腸上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)譜的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERp29在電離輻射后表達(dá)顯著升高；同時，我們以大鼠空腸上皮細(xì)胞株IEC-6作

3、為離體模型，也發(fā)現(xiàn)ERp29在電離輻射后表達(dá)顯著增加；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：IEC-6細(xì)胞中ERp29mRNA的表達(dá)在電離輻射后隨時間增加而增加。進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，ERp29作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，其功能研究主要定位于參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊與運(yùn)輸?shù)姆肿影閭H，但未見有關(guān)ERp29在電離輻射中作用的研究報(bào)道，我們推測：在電離輻射引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中，ERp29基因是一個輻射損傷的修復(fù)基因。因此，有必要研究電離輻射中該分子表達(dá)升高的原因、是否對電離輻射

4、具有保護(hù)作用及其在電離輻射中的作用機(jī)制。 對于基因功能的研究，一般多采用基因敲除(knockout)或基因表達(dá)降低(knockdown)等方法，RNA干擾作為抑制特異基因表達(dá)的重要手段，可以簡單、有效、特異地下調(diào)細(xì)胞中基因的表達(dá)，用于研究某個特定基因在特定階段的功能。為了深入探討ERp29基因在腸上皮細(xì)胞電離輻射損傷修復(fù)中的作用，本課題以輻射敏感的腸上皮細(xì)胞株IEC-6為研究對象，通過RNA干擾抑制ERp29表達(dá)，旨在探討抑制E

5、Rp29基因表達(dá)對IEC-6細(xì)胞放射損傷修復(fù)的影響。取得了如下結(jié)果： 一、成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pAVU6-siERp29 選擇大鼠ERp29基因作為靶基因，根據(jù)靶序列選取的一般原則結(jié)合生物信息學(xué)，選取了一條對ERp29基因有效且特異的siRNA序列，體外合成帶有SalⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的55nt寡核苷酸，經(jīng)退火后形成shRNA，與SalⅠ和XbaⅠ酶切的線性化質(zhì)粒pAVU6+27定向連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B。連接成功的

6、質(zhì)粒命名為pAVU6-siERp29，另以空載體作為陰性對照，命名為pAVU6+27。這些質(zhì)粒均經(jīng)過酶切和測序鑒定。為了減少質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量，提高轉(zhuǎn)染效率，本實(shí)驗(yàn)將抽提的各組質(zhì)粒均采用乙醇沉淀法純化后備用。 二、低表達(dá)ERp29細(xì)胞克隆的篩選鑒定 利用pAVU6+27質(zhì)粒和IEC-6細(xì)胞摸索脂質(zhì)體Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染條件，先后對細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞融合度、質(zhì)粒純度、DNA與脂質(zhì)體的比例、實(shí)驗(yàn)操作等多種因素進(jìn)

7、行了優(yōu)化，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們使用細(xì)胞融合度達(dá)90％、DNA與Lipofectamine2000比例為0.8ug∶2μ1的轉(zhuǎn)染條件，以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染篩選實(shí)驗(yàn)共分為三組：實(shí)驗(yàn)組(IEC-siERp29)、陰性對照組(IEC-pAVU6)和未轉(zhuǎn)染組(僅加Lipofectamine2000)，經(jīng)過致死劑量G418篩選和極低密度稀釋接種法，約4周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，在維持G418篩選壓力下逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，將篩選獲得的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的

8、PCR檢測，證實(shí)了pAVU6-siERp29質(zhì)粒在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中的存在。在此基礎(chǔ)上采用Westernblot檢測各組細(xì)胞ERp29的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：陰性對照組與未轉(zhuǎn)染組相比，ERp29的表達(dá)差異不顯著，而實(shí)驗(yàn)組ERp29表達(dá)明顯低于對照組細(xì)胞，為正常的28％，說明構(gòu)建的ERp29基因RNA干擾質(zhì)粒在篩選獲得的IEC-6細(xì)胞中發(fā)揮了作用。 三、ERp29的輻射保護(hù)作用 采用Westernblot檢測正常IEC-6細(xì)胞電離輻

9、射后ERp29的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)：不同劑量照射后ERp29表達(dá)均高于電離輻射前；5Gy時ERp29表達(dá)隨照射后時間的增加有增加的趨勢；電離輻射后ERp29表達(dá)與照射劑量之間沒有明顯的量效關(guān)系。從形態(tài)學(xué)觀察低表達(dá)ERp29腸上皮細(xì)胞，細(xì)胞貼壁，呈多角形，折光性較好，少量細(xì)胞脫壁、懸浮。采用流式技術(shù)檢測細(xì)胞周期顯示：59.26％處于生長前期(G1)，21.09％處于DNA合成期(S)，生長后期(G2)占19.65％，凋亡占3.34％。說明

10、大部分細(xì)胞生長狀況良好，只有少數(shù)細(xì)胞凋亡。MTT檢測篩選細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖明顯低于對照組，說明ERp29對正常IEC-6細(xì)胞具有增殖調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上觀察電離輻射后低表達(dá)ERp29腸上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：γ射線照射后，大量細(xì)胞脫壁、懸浮，貼壁的細(xì)胞仍呈多角形，其中實(shí)驗(yàn)組較對照組細(xì)胞死亡嚴(yán)重，時間較早，數(shù)量較多；陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞死亡差別不顯著。同樣采用MTT法檢測在10Gy和20Gy照射劑量時實(shí)驗(yàn)

11、組和對照組的差異，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活數(shù)目較對照組明顯降低；10Gy和20Gy照射后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活數(shù)目低于照射前；照射后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率隨照射后時間的增加而減少；未轉(zhuǎn)染組與陰性對照組細(xì)胞存活均無顯著差異。初步證實(shí)了ERp29是一個電離輻射所致的效應(yīng)分子，具有輻射保護(hù)作用。為了準(zhǔn)確反映離體細(xì)胞存活率，采用細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)法，觀察ERp29在低表達(dá)狀態(tài)下細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：經(jīng)2Gy、4Gy和6Gyγ射線照射后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆數(shù)及克隆形成率較

12、對照組顯著降低，且各組細(xì)胞克隆數(shù)隨著照射劑量的增加而減少，各照射劑量下未轉(zhuǎn)染組與陰性對照組細(xì)胞活力均無顯著差異。說明抑制ERp29基因在IEC-6細(xì)胞中的表達(dá)可以降低電離輻射后細(xì)胞活性，進(jìn)一步證明ERp29具有輻射保護(hù)作用。 結(jié)論: 一、有效的體外合成siRNA可適用于質(zhì)粒載體介導(dǎo)的RNA干擾，具有長期表達(dá)的優(yōu)勢，大大提高實(shí)驗(yàn)效率，有利于長期深入研究基因功能。 二、針對ERp29基因的RNA干擾表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染I

13、EC-6細(xì)胞后，能夠特異性抑制該基因表達(dá)，沉默效率72％，為功能研究提供了低表達(dá)ERp29的細(xì)胞平臺。 三、蛋白水平檢測電離輻射后ERp29表達(dá)增高，但與照射劑量之間無明顯量效關(guān)系，提示電離輻射誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞高表達(dá)ERp29，為內(nèi)源性輻射保護(hù)效應(yīng)。 四、轉(zhuǎn)染pAVU6-siERp29后IEC-6細(xì)胞增殖明顯降低，說明ERp29對正常腸上皮細(xì)胞具有增殖調(diào)控作用。 五、在ERp29基因表達(dá)抑制的基礎(chǔ)上，電離輻射后實(shí)驗(yàn)

14、組細(xì)胞較對照組死亡嚴(yán)重，時間較早，數(shù)量較多；MTT檢測和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率和細(xì)胞活性較陰性對照組及未轉(zhuǎn)染組明顯降低，初步證明了ERp29具有輻射保護(hù)作用，提示該基因可作為電離輻射損傷修復(fù)的靶點(diǎn)。 電離輻射可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而ERp29作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，是一電離輻射所致的效應(yīng)分子，初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)其促進(jìn)細(xì)胞增殖，具有輻射保護(hù)作用，推測ERp29在輻射誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮作用，但作用機(jī)制還有待下一步深