當(dāng)歸多糖對輻射損傷小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的作用研究.pdf

1、骨髓造血微環(huán)境為造血細(xì)胞的發(fā)育成熟提供了一個(gè)良好的場所,其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cell,BMsc)起著重要作用,BMSC除直接作用于造血細(xì)胞外,其表面的黏附分子可促使造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cell,HSPC)與BMSC以及微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)相互黏附,進(jìn)而促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖分化。血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion m

2、olecule-1,VCAM-1,CD106)及細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1,CD54)主要在BMSC上表達(dá),可介導(dǎo)BMSC與HSPC的黏附,利于造血細(xì)胞的分化成熟,同時(shí)在一些細(xì)胞因子作用下還參與HSPC的動(dòng)員和歸巢。BMSC還可分泌一些細(xì)胞因子調(diào)控造血,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是BMSC分泌

3、的一種糖蛋白,可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、移行,提高血管的通透性,促進(jìn)新生血管形成。
　　 輻射會(huì)對機(jī)體造成損害,尤其是造血系統(tǒng)更易受損。輻射損傷后BMSC細(xì)胞數(shù)明顯減少,大多被阻滯于G0/G1期;細(xì)胞增殖能力受損,使得BMSC形成成纖維細(xì)胞集落(colony forming unit-fibroblast,CFU-F)能力明顯下降;輻射損傷還可增加BMSC的凋亡率;另外輻射損傷還會(huì)影響B(tài)MSC表面黏附分子的表達(dá)以及抑制其細(xì)胞因

4、子的分泌,使BMSC調(diào)控造血的功能抑制,最終導(dǎo)致造血功能障礙。
　　 輻射防護(hù)劑的研究已開展多年,以往的化學(xué)輻射防護(hù)劑由于毒副作用大而影響其效果,因此期待開發(fā)出毒性較小、可用于臨床的中藥輻射防護(hù)劑。當(dāng)歸是一種活血化瘀中藥,主要成分為當(dāng)歸多糖(angelicapolysaccharide,APS),研究表明,APS可促進(jìn)急性輻射損傷小鼠外周血象和淋巴細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù),提高組織的抗氧化能力,具有一定的抗輻射功能,但APS對輻射損傷后骨

5、髓基質(zhì)細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道?；诖?我們以BMSC細(xì)胞周期、CFU-F數(shù)量、細(xì)胞凋亡率、表面黏附分子CD54、CD106以及VEGF mRNA的表達(dá)變化為切入點(diǎn),研究APS促進(jìn)輻射損傷小鼠造血功能恢復(fù)的可能機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型的建立均采用直線加速器全身照射BALB/c小鼠,研究APS對輻射損傷小鼠BMSC表面黏附分子表達(dá)及其血管生長因子表達(dá)的影響,為進(jìn)一步探討APS作為一種輻射防護(hù)劑應(yīng)用于臨床提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

6、　　 目的:研究APS對急性放射損傷小鼠BMSC增殖能力、細(xì)胞凋亡率及表面黏附分子和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響,進(jìn)而深入了解APS促進(jìn)輻射損傷后骨髓造血功能恢復(fù)的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組:正常組不作任何處理。其余BALB/c小鼠全身均勻照射x射線,總劑量4.0Gy,時(shí)間1.33min,照射后按給予不同藥物和劑量分為生理鹽水(saline,NS)組、2 mg/kgAPS組和8 mg

7、/kgAPS組。
　　 2.常規(guī)方法計(jì)數(shù)外周血WBC、RBC、PLT及單根股骨骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cell,BMNC)。
　　 3.常規(guī)方法培養(yǎng)BMSC,觀察小鼠BMSC的貼壁情況及細(xì)胞80％貼壁時(shí)間。
　　 4.常規(guī)方法培養(yǎng)BMSC,計(jì)數(shù)各組CFU-F數(shù)。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測放射損傷小鼠BMSC細(xì)胞周期的變化以及APS對它的影響。
　　 6流式細(xì)

8、胞術(shù)檢測APS對放射損傷小鼠BMSC凋亡率的影響。
　　 7.流式細(xì)胞術(shù)檢測APS對放射損傷小鼠BMSC黏附分子CD54和CD106表達(dá)的影響。
　　 8.RT-PCR方法檢測APS對放射損傷小鼠BMSC的VEGF mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.急性放射損傷模型的建立:小鼠照射后表現(xiàn)為飲水、進(jìn)食均減少,行動(dòng)遲緩,嗜睡,皮毛略凌亂,光澤性差,偶爾會(huì)有腹瀉,小鼠之間相互靠攏。
　　

9、 2.外周血WBC、RBC、PLT及BMNC的變化:照射后7,14,21d NS組小鼠外周血各指標(biāo)及BMNC較正常組均降低(P＜0.05);同時(shí)間點(diǎn)APS組較NS組WBC、PLT及BMNC下降幅度小,恢復(fù)快(P＜0.05),第14,21d8 mg/kgAPS組WBC比2 mg/kgAPS組恢復(fù)快(P＜0.05),同時(shí)間點(diǎn)8 mg/kg APS組BMNC數(shù)均明顯高于2 mg/kg APS組(P＜0.05),各指標(biāo)僅21d8 mg/kg A

10、PS組恢復(fù)正常;照射后小鼠第7d APS組較NS組RBC下降幅度大(P＜0.05),但恢復(fù)快,第14d的8 mg/kgAPS組和第21 d的2 mg/kg APS組RBC開始升高,且8 mg/kg APS組在第21d已恢復(fù)至正常水平。
　　 3.BMSC生長達(dá)80%貼壁時(shí)間比較:照射后7,14,21d NS組BMSC達(dá)80%貼壁時(shí)間明顯延長,與正常組有顯著差異(P＜0.05);同一時(shí)間點(diǎn)APS組比NS組更快達(dá)80%貼壁(P＜0.

11、05),但8 mg/kg APS組與2 mg/kg APS組比較BMSC貼壁時(shí)間差異不顯著,第21d APS組BMSC已恢復(fù)正常貼壁能力。
　　 4.成纖維細(xì)胞集落(CFU-F)數(shù)量變化:照射后7,14,21d NS組BMSC培養(yǎng)形成CFU-F數(shù)明顯少于正常組,差異顯著(P＜0.05);第7d APS組與NS組比較,CFU-F數(shù)量無明顯差異,而第14,21d APS組形成的集落數(shù)明顯高于同時(shí)間點(diǎn)的NS組(P＜0.05),第7,1

12、4 d8 mg/kg APS組CFU-F數(shù)與2 mg/kg APS組相比無明顯差異,第21d8 mg/kg APS組CFU-F數(shù)顯著多于2 mg/kg APS組(P＜0.05),與正常組無明顯差異。
　　 5.BMSC細(xì)胞周期的變化:照射后7,14,21d NS組BMSC多數(shù)處于Go/G1期,S期合成減少,與正常組相比差異顯著(P＜0.05);第7d不同組間相比G0/G1期無差異,第14,21d APS組Go/G,期細(xì)胞所占比例

13、明顯低于NS組(P＜0.05),同時(shí)間點(diǎn)2 mg/kgAPS組與NS組相比S期均無明顯改變,但8 mg/kg APS組比NS組S期合成明顯活躍(P＜0.05);第14,21d8 mg/kg APS組與2 mg/kg APS組相比細(xì)胞周期各時(shí)相比例恢復(fù)更快(P＜0.05),第21d恢復(fù)正常。
　　 6.BMSC細(xì)胞凋亡率的改變:照射后第7,14,21d NS組BMSC細(xì)胞凋亡率較正常組均明顯增高(P＜0.05);同一時(shí)間點(diǎn)APS組

14、較NS組細(xì)胞凋亡率減少(P＜0.05),但2 mg/kg APS組與8 mg/kg APS組比較無明顯差異,第21dAPS組細(xì)胞凋亡率已降至正常水平。
　　 7.BMSC表面黏附分子CD54和CDl06的表達(dá)變化:照射后第7.14,21 d NS組BMSC表面黏附分子CD54和CD106陽性率較正常組明顯降低(P＜0.05);同一時(shí)間點(diǎn)APS組較NS組CD54和CD106陽性率高,差異顯著(P＜0.05),但同時(shí)間點(diǎn)8 mg/k

15、gAPS組與2 mg/kgAPS組相比,CD54陽性率差異不明顯,而8 mg/kg APS組的CD106陽性率要高于2 mg/kgAPS組,有顯著性差異(P＜0.05),第21dAPS組的CD54和8 mg/kg APS組的CD106已恢復(fù)至正常水平。
　　 8.BMSC VEGF mRNA表達(dá)的變化:照射后第7,14,21d NS組BMSC VEGF mRNA表達(dá)較正常組顯著降低(P＜0.05);同一時(shí)間點(diǎn)APS組VEGF m

16、RNA均明顯高于NS組(P＜0.05),8 mg/kg APS組與2 mg/kgAPS組之間差異不明顯,第21dAPS組已恢復(fù)至正常。
　　 結(jié)論:APS對輻射損傷小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用,進(jìn)而促進(jìn)造血功能的恢復(fù);其作用機(jī)制可能是APS促進(jìn)BMSC的增殖能力,降低細(xì)胞凋亡率,上調(diào)BMSC黏附分子CD54、CD106的表達(dá)從而增強(qiáng)細(xì)胞間黏附能力,刺激BMSC的VEGF分泌,促進(jìn)新生血管生成,以利于受損造血微環(huán)境的恢復(fù),為造血干