牛乳酪蛋白ACE抑制肽的Caco-2細(xì)胞水平轉(zhuǎn)運(yùn)吸收機(jī)制研究.pdf

1、牛乳中蛋白質(zhì)含量豐富，其中酪蛋白經(jīng)體外酶解可產(chǎn)生不同功能的活性肽，已有動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些肽類具有生理作用。這些活性肽多由3個(gè)以上氨基酸殘基組成，但對大于3個(gè)氨基酸殘基的多肽腸道吸收形式和吸收機(jī)制研究較少，闡明多肽的腸道吸收機(jī)制對活性肽的作用機(jī)理及功能評價(jià)顯得尤為重要。
　　本課題以牛乳酪蛋白為原料，對其進(jìn)行體外模擬消化，探討胃腸消化條件下的ACE（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）抑制肽及抗氧化肽活性，RP-HPLC分析水解液組成變化，LC-M

2、S/MS鑒定肽段序列；再通過體內(nèi)消化熒光標(biāo)記的牛乳酪蛋白，利用激光共聚焦顯微鏡、RP-HPLC及全波長功能讀數(shù)儀檢測FITC-酪蛋白水解物在大鼠腸道粘膜上的吸收情況；最后，建立Caco-2單層細(xì)胞模型，通過添加不同抑制劑研究6種ACE抑制肽在細(xì)胞水平的吸收形式及吸收機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　1．體外模擬消化牛乳酪蛋白水解物的生物活性研究。模擬胃、腸及胃腸聯(lián)合水解三種消化方式中，胃腸模擬消化的水解度最大，為25.51±0.41％

3、；通過ACE法及DPPH自由基法分別對水解液中ACE抑制活性及抗氧化活性進(jìn)行檢測，在消化1h內(nèi)，三種消化方式的DPPH自由基清除率都增加較快，分別增加了18.25±0.72%、25.82±1.15%和41.78±0.71%，在2h時(shí)胃腸聯(lián)合消化的DPPH自由基清除率達(dá)到最大為44.27±0.93%；胃腸聯(lián)合水解液的ACE抑制率顯著高于兩種單獨(dú)消化方式，并在消化2h時(shí)ACE抑制活性達(dá)到最高值68.03±1.14%。分析LC-MS/MS二級

4、質(zhì)譜鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)可能具有ACE活性的肽段有21種，活性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　2．FITC-牛乳酪蛋白大鼠體內(nèi)吸收研究。采用FITC（異硫酸熒光素）標(biāo)記酪蛋白，對標(biāo)記率為13.91%的樣品使用SDS-PAGE電泳評價(jià)FITC-酪蛋白在胃腸消化液中的穩(wěn)定性。結(jié)果表明人工胃液和腸液消化5h，消化液的分子量為11kDa左右，且熒光條帶清晰；Tricine-SDS-PAGE電泳檢測胃腸消化液，2h蛋白條帶主要集中在5kDa以下，熒光條帶清

5、晰，可用于跟蹤胃腸吸收情況。FITC-酪蛋白大鼠灌胃實(shí)驗(yàn)得出，在灌胃1h后十二指腸粘膜下層的熒光強(qiáng)度為1047.12±157.82RFU，占總熒光強(qiáng)度的3.3%，灌胃3h熒光顯著增強(qiáng)達(dá)到2073.44±119.31RFU，占總熒光強(qiáng)度的6.5%，激光共聚焦顯微鏡觀察可知酪蛋白水解物在大鼠體內(nèi)可被很快吸收。建立大鼠腸非翻轉(zhuǎn)模型，驗(yàn)證5kDa以下的FITC-酪蛋白水解液被小腸不同腸段的吸收率大小依次為：十二指腸吸收＞空腸吸收＞回腸吸收＞結(jié)腸

6、吸收，且主要被十二指腸吸收。
　　3．基于Caco-2細(xì)胞模型的ACE抑制肽吸收機(jī)制研究。Caco-2單層細(xì)胞膜模型指標(biāo)評價(jià)結(jié)果為：培養(yǎng)16天時(shí)細(xì)胞形態(tài)良好，生長均勻，單層膜基本成型；熒光黃的Papp為6.06×10-7；15天時(shí)AP/BL側(cè)酶活比為7.60，說明堿性磷酸酶已經(jīng)主要分布于AP側(cè)，極化現(xiàn)象已經(jīng)很明顯；單層膜的電阻為417Ω·cm2，以上各條件均已符合Caco-2單層膜的要求，說明Caco-2單層細(xì)胞模型建立成功。選擇

7、胃腸消化條件下產(chǎn)生的6種ACE抑制肽：IPP、RYLGY、LHLPLP、AYFYPEL、RPKHPIKHQ及WQVLPNAVPAK。合成6種ACE抑制肽探討其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。以RYLGY為模型，對影響ACE抑制肽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳轉(zhuǎn)膜條件為多肽濃度5mmol/L、轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間90min、pH7.4及轉(zhuǎn)運(yùn)方向由AP-BL。采用跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑氧化苯胂、去氧膽酸鈉、Gly-pro、維拉帕米、疊氮化鈉及MK-571鈉鹽研究6種ACE

8、抑制肽吸收機(jī)制。6種ACE抑制肽的吸收和外排機(jī)制如下：6種ACE抑制肽均是以旁路轉(zhuǎn)運(yùn)的方式通過小腸上皮細(xì)胞；IPP可能存在能量依賴性的外排作用；RYLGY、LHLPLP和RPKHPIKHQ均是以P糖蛋白進(jìn)行外排轉(zhuǎn)運(yùn)并且需要ATP提供能量；AYFYPEL是以P糖蛋白的方式進(jìn)行外排轉(zhuǎn)運(yùn)；WQVLPNAVPAK則是以 MRP2進(jìn)行外排轉(zhuǎn)運(yùn)且需要ATP提供能力。RP-HPLC表明6種肽均能完整通過Caco-2單層細(xì)胞膜，最后通過LC-MS/MS