EPA和DHA調(diào)控CacO-2細(xì)胞乳糜微粒組裝的機(jī)制研究.pdf

1、日糧脂類中的長鏈脂肪酸（Long chain fatty acid，LCFA）在進(jìn)入機(jī)體前必須在被腸上皮細(xì)胞吸收攝取后，經(jīng)歷一系列轉(zhuǎn)運(yùn)及組裝過程，最終以乳糜微粒(Chylomicron，CM)的形式分泌進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。為了闡明動物腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)日糧中不同種類LCFA的差異，本研究利用Caco-2細(xì)胞建立體外腸上皮細(xì)胞模型，從單層細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性以及酶/功能性蛋白表達(dá)兩個(gè)方面評價(jià)模型的有效性;在此基礎(chǔ)上研究n-3多不飽和脂肪酸(n-3 p

2、olyunsaturated fatty acids，n-3 PUFA)對Caco-2細(xì)胞CM合成及分泌的影響，通過放射性同位素標(biāo)記技術(shù)監(jiān)測CM合成過程中兩個(gè)重要底物（甘油三酯和載脂蛋白B）的合成情況，解釋在Caco-2細(xì)胞合成及分泌CM的過程中觀察到的不同脂肪酸的差異性;考慮到肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(Liver fatty acidbinding protein，L-FABP)可以攜帶LCFA入核調(diào)控基因表達(dá)，在揭示了脂肪酸處理與L-FA

3、BP表達(dá)量的關(guān)系后，構(gòu)建了L-FABP過表達(dá)載體并篩選出了有效抑制L-FABP表達(dá)的干擾序列，為后續(xù)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　1.Caco-2單層細(xì)胞模型的建立。利用電阻儀測定跨上皮細(xì)胞電阻(Transepithelialelectrical resistance，TEER)評價(jià)單層膜結(jié)構(gòu)的完整性和致密性，TEER值隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢，分化20d時(shí)TEER值平均可以達(dá)到570Ω·cm2;功能性結(jié)構(gòu)的形成通過透射電鏡

4、進(jìn)行確認(rèn)，分化21d的Caco-2細(xì)胞具有微絨毛及緊密連接這兩個(gè)很具有代表性的腸上皮細(xì)胞特有的超微結(jié)構(gòu);堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)作為極性分泌的刷狀緣酶可以反應(yīng)Caco-2細(xì)胞的分化進(jìn)程，培養(yǎng)21d時(shí)，ALP幾乎全部集中在頂端刷狀緣一側(cè);L-FABP作為脂質(zhì)代謝關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)量可以反應(yīng)脂質(zhì)代謝等生理功能是否完善，隨著分化的進(jìn)行Caco-2細(xì)胞內(nèi)L-FABP表達(dá)量逐漸增加，在分化成熟的Caco-2細(xì)胞中

5、L-FABP表達(dá)量很高。
　　2.DHA(Docosahexaenoic acid,22∶6)及EPA(eicosapentaenoic acid,20∶5)對Caco-2細(xì)胞CM組裝分泌的影響。MTT試驗(yàn)分析脂肪酸濃度對Caco-2細(xì)胞的脂質(zhì)毒性發(fā)現(xiàn)，600μmol/L濃度OA(Oleic acid，18∶1)處理下細(xì)胞的存活力仍然可以達(dá)到95％;往上室培養(yǎng)基中加入[1，2，3-3H]glycerol研究TG合成情況，相比對照組

6、，400μmol/L濃度的脂肪酸處理均可以顯著增加胞內(nèi)聚集的及培養(yǎng)基中分泌的[3H]triglyceride的量(P＜0.01)，標(biāo)記的TG的量隨著孵育時(shí)間的延長而增加，直到36h時(shí)，脂肪酸對TG合成的差異性才顯現(xiàn)出來，相比OA處理組，EPA處理組細(xì)胞內(nèi)聚集的以及培養(yǎng)基中分泌的[3H]triglyceride的量分別降低了16.5％和21％，DHA處理組則分別降低了23.2％和28％(P＜0.01);向上室培養(yǎng)基中加入[1-14C]脂肪

7、酸檢測細(xì)胞對不同脂肪酸的攝取效率，上室培養(yǎng)基中放射性元素的消失率及攝取進(jìn)入細(xì)胞的放射性元素的強(qiáng)度都相同(P＞0.05)，在處理12h～24h間約有50％～80％的脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，下室培養(yǎng)基中放射性元素的強(qiáng)度在三種脂肪酸處理間也沒有差異(P＞0.05);向上室培養(yǎng)基中加入[35S]methionine檢測載脂蛋白B(Apolipoprotein B，apoB)的合成情況，三種脂肪酸處理下，不管是胞內(nèi)聚集的還是培養(yǎng)基中分泌的被標(biāo)記的apo

8、B48及apoB100的量都顯著增加(P＜0.01)，EPA和DHA處理組顯著低于OA處理組(P＜0.01)，EPA和DHA處理組之間差異不顯著(P＞0.05);利用密度梯度離心分離測定脂蛋白發(fā)現(xiàn)，相比相同濃度的OA，400μmol/L的EPA和DHA可以顯著降低Caco-2細(xì)胞CM的分泌量（P＜0.01）。
　　3.脂肪酸處理與L-FABP表達(dá)量之間關(guān)系的確定及L-FABP過表達(dá)/干擾質(zhì)粒的構(gòu)建篩選。400μmol/L的OA、E

9、PA和DHA刺激36h均顯著增加了Caco-2細(xì)胞內(nèi)L-FABP的表達(dá)量(P＜0.01)，三種脂肪酸在刺激L-FABP表達(dá)的效果上沒有差異(P＞0.05);設(shè)計(jì)的4條shRNA干擾載體分別與測序正確的過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，利用western檢測L-FABP的表達(dá)，驗(yàn)證了過表達(dá)質(zhì)?？梢杂行Хg形成L-FABP，設(shè)計(jì)的干擾序列中shRNA2載體的干擾效率最高;轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞，干擾組L-FABP的表達(dá)量顯著低于干擾對照組(P＜0

10、.01)，過表達(dá)組L-FABP的表達(dá)量顯著高于過表達(dá)對照組（P＜0.01）。為后續(xù)探究脂肪酸對CM組裝分泌的影響是否依賴于L-FABP/PPARα信號通路奠定基礎(chǔ)。
　　以上結(jié)果表明:本試驗(yàn)條件下極性分化完全的Caco-2細(xì)胞可以作為研究小腸營養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝的體外模型，用于后續(xù)脂質(zhì)代謝的相關(guān)試驗(yàn);相比OA，EPA和DHA抑制Caco-2細(xì)胞CM分泌的作用并非由于脂肪酸攝取的差異造成，而是受TG及apoB合成減少的影響。闡明了日糧中