芽孢桿菌影響Caco-2細(xì)胞及小鼠抗氧化功能的研究.pdf

1、抗氧化系統(tǒng)是動物機體清除體內(nèi)多余活性氧、保護自身免受氧化損傷的重要體系,在維持動物健康方面發(fā)揮著十分重要的作用。芽孢桿菌作為一類優(yōu)質(zhì)、安全的益生菌已被開發(fā)成多種添加劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn),然而目前國內(nèi)外關(guān)于芽孢桿菌抗氧化的研究報道較少。本試驗通過體外抗氧化活性檢測,篩選到兩株具有較好體外抗氧化特性活性和一株活性相對較低的芽孢桿菌,分別研究了它們對Caco-2細(xì)胞和小鼠在氧化應(yīng)激狀態(tài)下抗氧化功能的影響。主要研究結(jié)果如下:(1)對本實驗室保存的1

2、2株芽孢桿菌進(jìn)行了體外抗氧化活性比較研究(包括清除DPPH自由基能力、清除羥自由基能力、還原性能和抗氧化酶類),結(jié)果表明:這12株芽孢桿菌的培養(yǎng)上清和無細(xì)胞提取物均具有較強的抗氧化活性。其中培養(yǎng)上清對DPPH的清除率為8％-48%,且具有還原性能以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物岐化酶(SOD)活力,但未檢測出羥自由基清除活性;無細(xì)胞提取物對DPPH清除率為29%-48%,同樣具有還原性能以及GSH-Px和SOD酶活力,且

3、其中有11株菌具有羥自由基清除能力(清除率3%-16%)。根據(jù)以上結(jié)果,篩選出體外抗氧化活性較高的菌株B1(枯草芽孢桿菌)和B3(解淀粉芽孢桿菌)及活性相對較低的菌株B10(枯草芽孢桿菌)作進(jìn)一步研究。(2)分別在Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)液中添加終濃度為0、50、100、200μmol/L的H2O2,研究其對培養(yǎng)12h、24h和48h后Caco-2細(xì)胞的影響,結(jié)果表明,50μmol/LH2O2在48h內(nèi)對Caco-2細(xì)胞沒有產(chǎn)生明顯的氧化損

4、傷,處理前后細(xì)胞存活率與乳酸脫氫酶(LDH)活性均無顯著差異;100μmol/L的H2O2對Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生了可恢復(fù)的氧化損傷,表現(xiàn)為12h時細(xì)胞存活率顯著降低,48h時又顯著升高,但無法恢復(fù)到正常水平;200μmol/L的H2O2則對Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生了不可逆的氧化損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞存活率、LDH活性和清除自由基的能力均顯著降低(P＜0.05)。由此確定,在100μmol/L H2O2條件下培養(yǎng)12h可使Caco-2細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)

5、激。(3)研究了抗氧化劑特丁基對苯二酚(TBHQ)和芽孢桿菌(B1、B3和B10)對氧化應(yīng)激狀態(tài)下Caco-2細(xì)胞抗氧化功能的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,添加3株芽孢桿菌均顯著提高了細(xì)胞培養(yǎng)12h時培養(yǎng)上清的總抗氧化能力(P＜0.01),且在一定程度上降低了丙二醛(MDA)含量(P＞0.05),其中,菌株B10除提高培養(yǎng)上清抗O2·-能力、SOD和過氧化氫酶(CAT)活力外,還提高了細(xì)胞抑制羥自由基能力和過氧化物酶(POD)活力,而B

6、1和B3主要通過提高上清抗O2-活力、SOD和CAT活力以及胞內(nèi)POD和SOD活力來提高總抗氧化能力;添加3株芽孢桿菌均顯著提高了培養(yǎng)48h時的細(xì)胞總抗氧化能力(P＜0.01)、顯著降低了胞外LDH活力和MDA含量(P＜0.01)。此外,3株芽孢桿菌的抗氧化能力均顯著高于TBHQ(P<0.01).(4)選取平均體重為(35g±1g)的75只普通ICR雄性小鼠,隨機分為5組(A-E組),每組3個重復(fù),每個重復(fù)5只。其中,A組為對照組,飼喂

7、小鼠基礎(chǔ)日糧;B組為氧化應(yīng)激組,飼喂高脂日糧;C-E組為抗氧化劑組,在高脂日糧中分別添加0.01%TBHQ、0.1%B1和0.1%B10芽孢桿菌制劑(108CFU/g),試驗期30d。飼養(yǎng)試驗結(jié)束后,每個處理組隨機抽取6只小鼠,禁食不禁水12h后進(jìn)行眼球采血以得到血清,后頸椎脫臼處死,解剖取肝臟和小腸。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與B組相比,添加B1和B10芽孢桿菌制劑分別顯著降低了兩組小鼠的日增重57.89%(P＜0.01)和42.20%(P＜0.05

8、),而與對照組相比差異不明顯(P＞0.05),說明日糧中添加芽孢桿菌能顯著改善由高脂引起的小鼠肥胖癥;同時,添加芽孢桿菌B1和B10均顯著降低了肝臟中甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量(P＜0.01),顯著提高了高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量(P＜0.01);此外,兩株菌可顯著降低小鼠血清中葡萄糖濃度、GOT和GPT活力(P＜0.01),說明芽孢桿菌可降低高脂引起的對小鼠肝臟的損傷。在抗氧化功能方面,添加芽孢桿菌提高了小鼠肝臟

9、、腸粘膜及血清的部分抗氧化能力,但兩株菌表現(xiàn)出一定的差異。其中,菌株B1顯著提高了小鼠肝臟中GSH和CAT活力(P＜0.05)以及腸粘膜總抗氧化能力(P＜0.05),并顯著降低了肝臟中MDA含量(P＜0.05)和XOD活性(P＜0.05):而菌株B10顯著提高了小鼠肝臟中GSH-Px活力(P＜0.01)、腸粘膜SOD活力(P＜0.01)和抗O2-活力(P＜0.01),顯著降低了肝臟中MDA含量(P＜0.01),對小鼠肝臟和腸粘膜的總抗氧

10、化能力無顯著影響(P>0.05);兩株菌的添加均顯著提高了小鼠血清中總抗氧化能力、GSH和GSH-Px活力(P＜0.05)。益生菌的添加均顯著降低了小鼠肝臟中8-OHdG含量(P＜0.01),但對腸粘膜中8-OHdG含量無顯著影響。綜上所述,芽孢桿菌不僅能夠通過自身分泌酶類及非酶類抗氧化物質(zhì)發(fā)揮清除自由基的作用,還能促進(jìn)細(xì)胞和機體在氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生更強的抗氧化能力來清除自由基,并減少自由基所引起的氧化損傷。同時芽孢桿菌還能通過降低肝臟