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文檔簡介
1、目的:長期的高氧治療會(huì)對(duì)機(jī)體器官有嚴(yán)重的毒性作用?;钚匝?reactiveoxygen species,ROS)包括超氧自由基和過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2),過多生成的ROS對(duì)機(jī)體來說是有害的。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)是炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì),作為一種促炎細(xì)胞因子能夠在高氧狀態(tài)下介導(dǎo)炎癥反應(yīng),同時(shí)炎癥反應(yīng)時(shí),ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,并且增加的細(xì)胞因子會(huì)影響免
2、疫球蛋白A(ImmunoglobulinA,IgA)和分泌片(secretory component,SC)的表達(dá),過量產(chǎn)生的ROS通過轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)信號(hào)通路擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase1,ASK1)作為MAPK家族的一個(gè)成員能夠被ROS、TNF-a激活,并且在由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用
3、。低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor-1-α,HIF-1-α)在修復(fù)缺氧誘導(dǎo)基因和細(xì)胞氧環(huán)境中起著關(guān)鍵作用,與炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制高度相關(guān)。
因此通過檢測腸上皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化進(jìn)一步探討ROS在高氧誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用,通過檢測NF-κB信號(hào)通路、ASK1和HIF-1-α的變化探討ROS參與高氧誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制。
研究方法:本研究利用不同濃度的過氧化氫和高氧體外
4、刺激腸上皮Caco-2細(xì)胞(Caco-2細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所),細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清,1%谷氨酰胺,1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中,放入37℃和5% CO2孵箱中培養(yǎng)。每2到3天換一次培養(yǎng)基,處理前,將細(xì)胞(1×106 ml)傳代,第二天,細(xì)胞在不同濃度的H2O2(100,200和400μM)和85%氧(三氣培養(yǎng)箱,85%的氧氣和5%的二氧化碳)中孵育24小時(shí),未加任何處理因素的作為對(duì)照組。24小時(shí)后收集細(xì)胞,
5、分別提取全蛋白質(zhì)、RNA和進(jìn)行其他不同的實(shí)驗(yàn),即采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的含量;MTT檢測細(xì)胞生存能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平;免疫組化方法檢測Caco-2細(xì)胞RelA、RelB、HIF-1-α、TNF-α和SC的表達(dá)情況;Western Blot方法檢測Caco-2細(xì)胞RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC蛋白的表達(dá)水平;Real-time PCR方法檢測Caco-2細(xì)胞RelA、RelB、ASK、H
6、IF-1-α、TNF-α和SC mRNA的表達(dá)水平。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)6到8次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示,采用Prism Graph6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,多組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)(unpaired t-test),結(jié)果以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:1、ROS檢測結(jié)果顯示對(duì)照組(21.45±9.34)有少量的ROS表達(dá),實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2中隨著H2O2濃度的增加ROS的
7、表達(dá)逐漸增加,而高氧組(139.19±34.79)ROS的表達(dá)最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);2、MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組(1.25±0.25)相比,100μM H2O2、200μMH2O2、400μM H2O2組中細(xì)胞的存活率均明顯下降(P<0.01),高氧組(0.52±0.06)細(xì)胞存活率下降更明顯(P<0.01);3、細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示細(xì)胞被H2O2和高氧處理6小時(shí)后,實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2(9.70±3.
8、14)、200μM H2O2(10.73±2.29)、400μM H2O2(11.52±2.80)和85%高氧組(17.90±5.91)細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(4.60±1.98);細(xì)胞被H2O2和高氧處理12小時(shí)后,實(shí)驗(yàn)組100μMH2O2、200μMH2O2、400μMH2O2和85%高氧組(15.95±3.56)細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(5.33±2.62),細(xì)胞凋亡率隨著ROS濃度的增加而升高,并且高氧組細(xì)胞凋亡率最高(P<0
9、.01);但細(xì)胞被H2O2和高氧處理24小時(shí)后,實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2、200μMH2O2、400μM H2O2和85%高氧中細(xì)胞凋亡率反而降低(P<0.01)。不同濃度的H2O2及高氧處理6小時(shí)和12小時(shí)后,其細(xì)胞凋亡率明顯高于24小時(shí)(P<0.01)。但死亡率卻相反,即H2O2和高氧處理6小時(shí)細(xì)胞死亡率分別為:100μMH2O2(1.20±0.37)、200μM H2O2(9.52±2.03)、400μM H2O2(15.26±
10、2.39)及高氧(19.64±1.80);處理12小時(shí)細(xì)胞死亡率分別為:100μMH2O2(8.67±0.14)、200μM H2O2(12.95±1.99)、400μM H2O2(17.76±1.50)及高氧(23.31±1.66);處理24小時(shí)細(xì)胞死亡率分別為100μM H2O2(6.23±3.83)、200μM H2O2(14.74±1.24)、400μM H2O2(19.90±4.57)及高氧(37.35±6.55),6小時(shí)細(xì)胞
11、死亡率明顯低于12小時(shí)和24小時(shí)(P<0.01);4、RelA、RelB、HIF-1-α、TNF-α和SC的免疫組化染色結(jié)果顯示對(duì)照組RelA和RelB位于細(xì)胞漿,呈淡黃色,在H2O2組和高氧組RelA和RelB位于細(xì)胞漿與細(xì)胞核,呈棕褐色。RelA與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2和高氧組的表達(dá)明顯升高(P<0.01);與高氧組相比,100μM H2O2、200μM H2O2和400μ
12、M H2O2處理的Caco-2細(xì)胞,RelA的表達(dá)較低(P<0.01)。RelB與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2和高氧組的表達(dá)明顯升高(P<0.01);與高氧組相比,100μM H2O2、200μM H2O2和400μMH2O2處理的Caco-2細(xì)胞,RelB的表達(dá)較低(P<0.01)。對(duì)照組TNF-α染色呈淺黃色,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈黃或棕褐色。100μM H2O2、200μM H2O2、4
13、00μM H2O2和高氧組處理后的Caco-2細(xì)胞TNF-α的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01);與高氧組相比,100μM H2O2、200μM H2O2和400μMH2O2處理的Caco-2細(xì)胞,TNF-α的表達(dá)較低(P<0.01)。HIF-1-α主要集中于細(xì)胞漿,在對(duì)照組有少量的表達(dá)呈淺黃色,在H2O2組和高氧組HIF-1-α陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,染色呈黃或棕褐色。與對(duì)照組相比,HIF-1-α在100μM H2O2、200μMH2O2
14、、400μM H2O2和高氧組中表達(dá)升高(P<0.01);與高氧組相比,100μMH2O2、200μMH2O2和400μM H2O2處理的Caco-2細(xì)胞,HIF-1-α的表達(dá)較低(P<0.01)。SC主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,與對(duì)照組相比,SC在200μM H2O2和400μM H2O2和高氧組中表達(dá)明顯升高(P<0.01);與高氧組相比,100μM H2O2、200μM H2O2和400μM H2O2處理的Caco-2細(xì)胞,SC的表達(dá)
15、較低(P<0.01)。5、Western Blot結(jié)果表明在H2O2和高氧處理的Caco-2細(xì)胞中,RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC的蛋白表達(dá)水平顯著上升,高氧組RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、 TNF-α和SC的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC(P<0.01)。6、Real-time PCR結(jié)果表明在H2O2和高氧處理的Caco-2細(xì)胞
16、中,RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC的mRNA表達(dá)水平顯著上升,高氧組RelA(1.77±0.27)、RelB(2.23±0.53)、ASK1(1.81±0.35)、HIF-1-α(1.90±0.40)、TNF-α(2.14±1.04)和SC(2.10±0.67)的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組RelA(0.71±0.22)、RelB(0.58±0.15)、ASK1(0.80±0.19)、HIF-1-α(0
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