高氧環(huán)境中ROS對Caco-2細胞的作用及相關基因表達水平的影響.pdf

1、目的:長期的高氧治療會對機體器官有嚴重的毒性作用?；钚匝?reactiveoxygen species，ROS)包括超氧自由基和過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)，過多生成的ROS對機體來說是有害的。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)是炎癥反應的中心介質，作為一種促炎細胞因子能夠在高氧狀態(tài)下介導炎癥反應，同時炎癥反應時，ROS能夠誘導細胞因子的產生，并且增加的細胞因子會影響免

2、疫球蛋白A(ImmunoglobulinA，IgA)和分泌片（secretory component，SC）的表達，過量產生的ROS通過轉錄因子蛋白家族(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路擴大炎癥反應。凋亡信號調節(jié)激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase1，ASK1）作為MAPK家族的一個成員能夠被ROS、TNF-a激活，并且在由氧化應激誘導的細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用

3、。低氧誘導因子(Hypoxia inducible factor-1-α，HIF-1-α)在修復缺氧誘導基因和細胞氧環(huán)境中起著關鍵作用，與炎癥性腸病的發(fā)病機制高度相關。
　　因此通過檢測腸上皮細胞內ROS水平的變化進一步探討ROS在高氧誘導的腸上皮細胞炎癥反應中的作用，通過檢測NF-κB信號通路、ASK1和HIF-1-α的變化探討ROS參與高氧誘導腸上皮細胞炎癥反應機制。
　　研究方法:本研究利用不同濃度的過氧化氫和高氧體外

4、刺激腸上皮Caco-2細胞（Caco-2細胞株購于中國科學院上海細胞生物學研究所），細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清，1％谷氨酰胺，1％雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放入37℃和5％ CO2孵箱中培養(yǎng)。每2到3天換一次培養(yǎng)基，處理前，將細胞(1×106 ml)傳代，第二天，細胞在不同濃度的H2O2(100，200和400μM)和85％氧（三氣培養(yǎng)箱，85％的氧氣和5％的二氧化碳）中孵育24小時，未加任何處理因素的作為對照組。24小時后收集細胞，

5、分別提取全蛋白質、RNA和進行其他不同的實驗，即采用流式細胞術檢測細胞內ROS的含量;MTT檢測細胞生存能力;流式細胞術檢測細胞凋亡水平;免疫組化方法檢測Caco-2細胞RelA、RelB、HIF-1-α、TNF-α和SC的表達情況;Western Blot方法檢測Caco-2細胞RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC蛋白的表達水平;Real-time PCR方法檢測Caco-2細胞RelA、RelB、ASK、H

6、IF-1-α、TNF-α和SC mRNA的表達水平。所有的實驗重復6到8次。實驗數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，采用Prism Graph6.0軟件統(tǒng)計分析，多組間比較采用非配對t檢驗(unpaired t-test)，結果以P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1、ROS檢測結果顯示對照組(21.45±9.34)有少量的ROS表達，實驗組100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2中隨著H2O2濃度的增加ROS的

7、表達逐漸增加，而高氧組（139.19±34.79）ROS的表達最高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);2、MTT細胞增殖實驗結果顯示與對照組(1.25±0.25)相比，100μM H2O2、200μMH2O2、400μM H2O2組中細胞的存活率均明顯下降(P＜0.01)，高氧組(0.52±0.06)細胞存活率下降更明顯(P＜0.01);3、細胞凋亡檢測結果顯示細胞被H2O2和高氧處理6小時后，實驗組100μM H2O2(9.70±3.

8、14)、200μM H2O2(10.73±2.29)、400μM H2O2(11.52±2.80)和85％高氧組(17.90±5.91)細胞凋亡率明顯高于對照組(4.60±1.98);細胞被H2O2和高氧處理12小時后，實驗組100μMH2O2、200μMH2O2、400μMH2O2和85％高氧組(15.95±3.56)細胞凋亡率明顯高于對照組(5.33±2.62)，細胞凋亡率隨著ROS濃度的增加而升高，并且高氧組細胞凋亡率最高(P＜0

9、.01);但細胞被H2O2和高氧處理24小時后，實驗組100μM H2O2、200μMH2O2、400μM H2O2和85％高氧中細胞凋亡率反而降低(P＜0.01)。不同濃度的H2O2及高氧處理6小時和12小時后，其細胞凋亡率明顯高于24小時(P＜0.01)。但死亡率卻相反，即H2O2和高氧處理6小時細胞死亡率分別為:100μMH2O2（1.20±0.37）、200μM H2O2（9.52±2.03）、400μM H2O2（15.26±

10、2.39）及高氧（19.64±1.80）;處理12小時細胞死亡率分別為:100μMH2O2（8.67±0.14）、200μM H2O2（12.95±1.99）、400μM H2O2（17.76±1.50）及高氧（23.31±1.66）;處理24小時細胞死亡率分別為100μM H2O2(6.23±3.83)、200μM H2O2(14.74±1.24)、400μM H2O2(19.90±4.57)及高氧（37.35±6.55），6小時細胞

11、死亡率明顯低于12小時和24小時(P＜0.01);4、RelA、RelB、HIF-1-α、TNF-α和SC的免疫組化染色結果顯示對照組RelA和RelB位于細胞漿，呈淡黃色，在H2O2組和高氧組RelA和RelB位于細胞漿與細胞核，呈棕褐色。RelA與對照組相比，實驗組100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2和高氧組的表達明顯升高(P＜0.01);與高氧組相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μ

12、M H2O2處理的Caco-2細胞，RelA的表達較低(P＜0.01)。RelB與對照組相比，實驗組100μM H2O2、200μM H2O2、400μM H2O2和高氧組的表達明顯升高(P＜0.01);與高氧組相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μMH2O2處理的Caco-2細胞，RelB的表達較低(P＜0.01)。對照組TNF-α染色呈淺黃色，實驗組細胞呈黃或棕褐色。100μM H2O2、200μM H2O2、4

13、00μM H2O2和高氧組處理后的Caco-2細胞TNF-α的表達明顯高于對照組(P＜0.01);與高氧組相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μMH2O2處理的Caco-2細胞，TNF-α的表達較低(P＜0.01)。HIF-1-α主要集中于細胞漿，在對照組有少量的表達呈淺黃色，在H2O2組和高氧組HIF-1-α陽性細胞數(shù)明顯增多，染色呈黃或棕褐色。與對照組相比，HIF-1-α在100μM H2O2、200μMH2O2

14、、400μM H2O2和高氧組中表達升高(P＜0.01);與高氧組相比，100μMH2O2、200μMH2O2和400μM H2O2處理的Caco-2細胞，HIF-1-α的表達較低(P＜0.01)。SC主要位于細胞膜和細胞漿，與對照組相比，SC在200μM H2O2和400μM H2O2和高氧組中表達明顯升高(P＜0.01);與高氧組相比，100μM H2O2、200μM H2O2和400μM H2O2處理的Caco-2細胞，SC的表達

15、較低(P＜0.01)。5、Western Blot結果表明在H2O2和高氧處理的Caco-2細胞中，RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC的蛋白表達水平顯著上升，高氧組RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、 TNF-α和SC的蛋白表達水平明顯高于對照組RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC(P＜0.01)。6、Real-time PCR結果表明在H2O2和高氧處理的Caco-2細胞

16、中，RelA、RelB、ASK1、HIF-1-α、TNF-α和SC的mRNA表達水平顯著上升，高氧組RelA(1.77±0.27)、RelB(2.23±0.53)、ASK1(1.81±0.35)、HIF-1-α(1.90±0.40)、TNF-α(2.14±1.04)和SC(2.10±0.67)的mRNA表達水平明顯高于對照組RelA(0.71±0.22)、RelB(0.58±0.15)、ASK1(0.80±0.19)、HIF-1-α(0