尿毒癥血清對阿托伐他汀在Caco-2細胞模型中轉(zhuǎn)運的影響.pdf

1、目的:
　　慢性腎臟病(Chronic kidney Disease，CKD)可以影響主要經(jīng)腎臟排泄的藥物的清除，慢性腎臟病患者在應(yīng)用此類藥物時，需調(diào)整劑量。但是CKD對主要經(jīng)過肝臟代謝或膽汁排泄的藥物的體內(nèi)過程的影響研究很少。研究表明，CKD患者體內(nèi)蓄積的尿毒癥毒素，在加速腎功能惡化，損害細胞和基質(zhì)蛋白的同時，還可以改變藥物的體內(nèi)過程。研究已經(jīng)證明，尿毒癥血清可以影響腸道轉(zhuǎn)運體的mRNA和蛋白的表達，但是目前尚無尿毒癥血清對藥物

2、經(jīng)腸道轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運影響的研究。阿托伐他汀(Atorvastatin，ATV)是慢性腎臟病患者常使用的藥物之一，在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟代謝、膽汁排泄，僅2％經(jīng)腎臟排泄。研究表明，在腸道轉(zhuǎn)運模型-Caco-2細胞模型中單羧酸轉(zhuǎn)運體-1(Monocarboxylate transporter, MCT1)和P-糖蛋白(P-glycorprotein，P-gp)轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)阿托伐他汀的吸收和外排。因此本課題利用Caco-2細胞模型，考察尿毒癥血清對阿托伐

3、他汀在小腸上皮細胞中轉(zhuǎn)運的影響，對MCT1介導(dǎo)阿托伐他汀吸收的影響和對P-gp介導(dǎo)阿托伐他汀外排的影響，探討阿托伐他汀在慢性腎衰竭患者腸道的吸收情況，為其臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.Caco-2細胞模型的建立和驗證
　　將對數(shù)生長期的Caco-2細胞接種到Transwell24孔板上培養(yǎng)21天，建立Caco-2單細胞層模型，以P-糖蛋白的陽性底物地高辛為探針藥物，并通過測定地高辛的表觀通透系數(shù)驗證

4、模型建立成功，同時利用電子顯微鏡掃描Caco-2細胞單層來觀察細胞形態(tài)學(xué)，并利用電阻儀測定單層膜的跨膜電阻值，考察Caco-2單細胞層模型的致密性和完整性。
　　2.驗證ATV在Caco-2細胞模型中的轉(zhuǎn)運情況
　　采用Caco-2單細胞層模型，通過測定阿托伐他汀自膜的基底面(Basolateralside，BL)側(cè)向絨毛面(Apical side，AP)側(cè)及AP側(cè)向BL側(cè)轉(zhuǎn)運時的表觀通透系數(shù)(apparent permea

5、bility，Papp)并計算其外排系數(shù)Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)，考察阿托伐他汀在Caco-2單細胞層模型中的轉(zhuǎn)運情況。
　　1.尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中經(jīng)P-gp外排時的影響
　　采用Caco-2單細胞層模型，以空白血清為對照，通過比較在40、80、120min時，尿毒癥血清組與空白血清組及P-gp抑制劑GG918組的表觀滲透系數(shù)，考察尿毒癥血清對ATV經(jīng)P-gp外排的影響。

6、　　2.尿毒癥血清對阿托伐他汀在Caco-2細胞模型中經(jīng)MCT1吸收時的影響
　　采用Caco-2單細胞層模型，以空白血清為對照，通過比較在40、80、120min時，尿毒癥血清組與空白血清組及MCT1抑制劑苯甲酸組的表觀滲透系數(shù)，考察尿毒癥血清對ATV經(jīng)MCT1吸收的影響。
　　結(jié)果:
　　1.Caco-2細胞模型的建立
　　經(jīng)過21天的培養(yǎng)周期，Caco-2細胞分化完全、形成緊密連接。選擇通過細胞位儀測定的跨

7、膜電阻值TEER大于400Ω·cm2的單層膜用于轉(zhuǎn)運試驗;隨著時間的增長，地高辛的跨膜轉(zhuǎn)運量逐漸增加，且120min時地高辛的表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)為11.3±0.7×106cm·s-1, Papp(AP→BL)為3.41±1.4×106cm·s-1，外排系數(shù)Papp(BL→ AP)/Papp(AP→BL)為3.31，表明其外排方向(BL→AP)占轉(zhuǎn)運的主導(dǎo)地位，與文獻報道相符，說明Caco-2細胞模型中P-gp表達水平高，

8、該模型可用于轉(zhuǎn)運試驗。
　　2.ATV在Caco-2細胞模型中的轉(zhuǎn)運考察
　　在符合條件的Caco-2細胞單層膜中，隨著時間的增長，ATV的跨膜轉(zhuǎn)運量逐漸增加，在80、120min時ATV的表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)和Papp(AP→BL)存在顯著性差異，且120min時Papp(BL→AP)為39.5±9.4×106cm·s-1，Papp(AP→BL)為2.55±0.8×106cm·s。1，外排系數(shù)Papp(BL→

9、AP)/Papp(AP→ BL)為15.4，表明其外排方向(BL→AP)占轉(zhuǎn)運的主導(dǎo)地位，與文獻中ATV的表觀滲透系數(shù)值接近。
　　3.尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中經(jīng)P-gp外排時的影響
　　ATV在空白血清、尿毒癥血清及P-gp抑制劑GG918的抑制劑組中經(jīng)P-gp外排時，在120min內(nèi)，P-gp的抑制劑GG918和尿毒癥血清抑制ATV的外排，與正常血清組相比，上述兩組ATV的Papp(BL→AP)值均降低

10、，并且在80min和120min時，尿毒癥血清ATV的Papp(BL→AP)顯著降低(p＜0.01，p＜0.05);另外，與抑制劑組相比，40、80、120min時尿毒癥血清組ATV的Papp(BL→AP)均降低，且在120min存在顯著性差異(p＜0.05)。
　　4.尿毒癥血清對ATV在Caco-2細胞模型中經(jīng)MCT1吸收時的影響
　　ATV在空白血清、尿毒癥血清及MCT1抑制劑苯甲酸的抑制劑組中經(jīng)MCT1吸收時，在12

11、0min內(nèi)，與正常血清組相比，加入競爭性抑制ATV經(jīng)MCT1吸收的苯甲酸抑制劑組ATV的Papp(AP→BL)值降低，說明抑制劑苯甲酸抑制ATV的吸收。同時，與正常血清組相比，尿毒癥血清也抑制其吸收，在40、80、120min時，該組ATV的Papp(AP→BL)顯著降低(p＜0.05、p＜0.05、p＜0.01);并且尿毒癥血清組Papp(AP→BL)值均小于抑制劑組，且在120min時存在顯著性差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論

12、:
　　1.本實驗通過將對數(shù)生長期的Caco-2細胞接種到Transwell24孔板上，經(jīng)過21天的培養(yǎng)周期，以P-糖蛋白的陽性底物地高辛為探針藥物，通過測定地高辛的表觀通透系數(shù)驗證模型建立成功，同時利用電子顯微鏡掃描Caco-2單細胞層觀察Caco-2細胞分化完全、形成緊密連接，選擇單層膜電阻＞400Ω·cm2的單層膜用于轉(zhuǎn)運實驗。本實驗中地高辛和待測化合物ATV在Caco-2單細胞層模型中的表觀滲透系數(shù)Papp(BL→AP)值

13、及Papp(AP→BL)值和文獻中報道中的數(shù)據(jù)接近，說明本實驗建立的Caco-2單細胞層模型穩(wěn)定可靠。
　　2.在Caco-2細胞模型中，尿毒癥血清對ATV經(jīng)P-gp外排和經(jīng)MCT1吸收的過程均具有抑制作用。提示:慢性腎功能衰竭患者的血清中可能含有可以抑制分別介導(dǎo)ATV外排和吸收的P-gp和MCT1活性的因子，從而影響ATV在腸道的吸收過程。此外，根據(jù)本實驗研究結(jié)果推測，尿毒癥血清可能同時影響腸道上皮細胞中介導(dǎo)阿托伐他汀吸收和外排