高壓氧-氫氣對缺氧—復氧期Caco-2細胞緊密連接完整性的影響.pdf

1、目的:我們之前為評估早期的缺血再灌注損傷而建立了體外的Caco-2細胞單層模型，其中自由基引發(fā)劑AAPH在脂質(zhì)膜氧化過程中發(fā)揮始動作用。腸缺血后的再灌注損傷通常是全身循環(huán)衰竭如低血容量及膿毒性休克的后果之一，并有較高的發(fā)病率和病死率。高壓氧在腦、小腸、睪丸、肢體擠壓傷的腸缺血再灌注損傷中是有效輔助手段。氫分子醫(yī)學已在多種病理模型證實為具有細胞保護作用及器官損害保護功能，已臨床用于多種疾病并有諸多優(yōu)點:抗氧化、抗炎、無害、無殘留、制備簡易

2、。雖然高壓氧對缺血性疾病有潛在的臨床價值，但目前其確切的保護作用仍不清楚。氫氣的保護作用也罕有體外細胞層面的實驗來支持。所以我們利用前述的模型探討高壓氧及氫氣在缺血再灌注中的干預作用。
　　方法:對培養(yǎng)好的Caco-2細胞單層，予以1小時的缺氧處理繼以以1小時的復氧過程，于不同時段加用高壓氧治療。氫氣則僅用于復氧期。分組遵循隨機、對照的原則（正常組、缺血/再灌注對照組）。處理后的標本組織學檢查采用HE染色、免疫熒光、硝酸鑭示蹤電鏡

3、，蛋白質(zhì)印跡分析和酚紅透過實驗也用于腸屏障功能的評估。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬└邏貉醺深A結(jié)果:①免疫熒光:三種緊密連接蛋白在分布上具有一致性，均沿細胞間質(zhì)膜連接處分布，正常組呈邊界清晰的蜂巢狀。在I/R和R組緊密連接破壞嚴重，緊密連接崩解消失多見，殘存緊密連接表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)松散、不連續(xù)，向膜外和胞質(zhì)內(nèi)雙向彌散。而P組、I組緊密連接顯示輕微破壞，與N組相似。②硝酸鑭示蹤電鏡:電鏡下I/R鏡下細胞破壞最重，以細胞碎片為主，難覓緊密連

4、接。R組緊密連接破壞嚴重，殘存部分可看到緊密連接開放及示蹤劑充填，I組可觀察到少量緊密連接開放，但損傷較輕，P組損傷輕并未見緊密連接開放。③蛋白印跡分析: ZO-1和Claud in-1在各組表達趨勢上表現(xiàn)一致，R組出現(xiàn)最小值，而最大值出現(xiàn)在I組。P組表現(xiàn)中等接近于N組。Occludin在各干預級均表現(xiàn)為不同程度的下降。④酚紅透過率實驗:復氧期結(jié)束時采樣測OD值并計算表觀滲透系數(shù)，最小值是N組，其次是I組，兩組間無顯著差異(P＞0.05

5、)而與其它各組不同(P＜0.05)，最高值為I/R組，次為R組，此兩組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)但與其它組間有顯著差異(P＜0.05)。P組中度表現(xiàn)，低于R及I/R組而比I和N組高，與其它任一組有顯著差異(P＜0.05)。
　　(二)氫氣干預結(jié)果:①HE染色:I/R對照組細胞粘附性下降，細胞崩解、脫落嚴重，細胞碎片隨處可見，殘留的細胞存在明顯的濁腫現(xiàn)象。而H2組普遍存在嗜伊紅深染及細胞濁腫，細胞脫落少見。N組細胞為典型腫瘤細胞表

6、現(xiàn)。②免疫熒光:I/R組緊密連接大部分破壞或消失，殘存緊密連接結(jié)結(jié)構(gòu)松散、不完整，并向膜外和胞質(zhì)內(nèi)雙向彌散。而H2組緊密連接大部分得到保留，但也顯示不同程度的雙向分布彌散。③磷酸化蛋白western blot:N組中磷酸化Claudin-1是其主要存在形式，在I/R組中磷酸化蛋白表達顯著下降，而H2組下降程度明顯少于I/R組。在I/R和H2組可觀察到其非磷酸化部分較正常組略多。④酚紅透過率實驗:復氧期結(jié)束時采樣測定OD值并計算表觀滲透系

7、數(shù)，最大值出現(xiàn)在I/R組，其次為H2組，最小為N組，三組間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:實驗結(jié)果證實在I/R組存在缺血再灌注損傷，此并造成緊密連接相關(guān)蛋白和細胞形態(tài)學的嚴重損傷和破壞，該組表觀滲透系數(shù)系最大值，證實實驗中I/R損傷帶來腸屏障功能的顯著下降。氫氣干預結(jié)果表現(xiàn)出顯著的緊密連接相關(guān)蛋白和細胞形態(tài)學的保護作用，證實其顯著的抗缺血-再灌注損傷作用及帶來的腸屏障功能顯著改善。高壓氧早期干預體現(xiàn)出顯著的緊密連接