探討高壓氧對(duì)缺氧-復(fù)氧模型下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重創(chuàng)傷性疾病，其致殘率及病死率均較高，所造成的部分或完全運(yùn)動(dòng)神經(jīng)、感覺(jué)神經(jīng)缺失給患者的生活造成巨大的影響。脊髓損傷的修復(fù)和治療一直是世界研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。而干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是人類發(fā)育生物學(xué)和疾病研究中的重大突破。干細(xì)胞是具有增殖和分化潛能的細(xì)胞，具有自我更新復(fù)制的能力，能夠產(chǎn)生高度分化的功能細(xì)胞，是形成哺乳類動(dòng)物的各組織器官的原始細(xì)胞，這種多能性使得干

2、細(xì)胞具有巨大的生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)潛能。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有高度的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，在一定的誘導(dǎo)條件下可跨胚層分化為神經(jīng)細(xì)胞，從而替代缺損的神經(jīng)功能;能促髓鞘再生、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌;調(diào)控炎癥反應(yīng)，減輕繼發(fā)性損傷對(duì)原位神經(jīng)元的毒害性。許多研究已經(jīng)表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠定向遷移到損傷組織中并定植（歸巢），發(fā)揮其龐大的神經(jīng)修復(fù)作用。然而，當(dāng)移植外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，缺血病灶中僅有2％存活，這與脊髓損傷引起

3、的繼發(fā)性損傷，包括谷氨酸鹽毒性物質(zhì)、超載氧自由基、炎癥細(xì)胞、各種細(xì)胞因子等有關(guān)。如何提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在病灶中的存活率成為目前新的研究靶點(diǎn)。
　　高壓氧在神經(jīng)系統(tǒng)缺血性疾病中的應(yīng)用已得到廣泛的認(rèn)可。其主要機(jī)制包括:①神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧有特殊的依賴性和敏感性，而高壓氧能顯著提高患者動(dòng)脈血氧分壓及組織氧儲(chǔ)量，增加氧彌散距離，改善脊髓缺氧狀態(tài)。②高壓氧能提高紅細(xì)胞變形能力，降低毛細(xì)血管通透性。③高壓氧能擴(kuò)張機(jī)體動(dòng)脈，促進(jìn)血流速度，減少血小板

4、聚集，降低血液粘滯度，從而增加脊髓供血。④高壓氧糾正酸中毒，改善脊髓損傷部位的微循環(huán)及血流灌注，維持神經(jīng)細(xì)胞能量代謝，并恢復(fù)可逆性損傷的神經(jīng)元功能。研究表明，高壓氧能夠調(diào)控凋亡家族中Bax、Bcl-2在脊髓損傷中的表達(dá)，維持線粒體細(xì)胞膜電位的穩(wěn)定性，減少細(xì)胞色素C的釋放，阻斷其下游caspase-3的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮抗凋亡作用。除此之外，高壓氧還能促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，這可能與Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

5、已有文獻(xiàn)報(bào)道聯(lián)合高壓氧治療的干細(xì)胞移植可明顯改善神經(jīng)缺損癥狀，但當(dāng)中的機(jī)制仍未明了。
　　Wnt通路在胚胎的發(fā)育過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、死亡、遷移和極化均起到重要的作用。β-catenin是經(jīng)典Wnt通路中的核心調(diào)控因子，其表達(dá)水平?jīng)Q定著通路的開放與否。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷環(huán)境，探討高壓氧對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，為細(xì)胞治療學(xué)應(yīng)用于脊髓損傷中的發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)

6、胞(BMSCs)的收集、培養(yǎng)及流式細(xì)胞鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志:選取健康的3-4周雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat)，采用全骨髓貼壁法種植于25cm2培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞傳至P3后選取CD29、45、90抗體并使用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞。
　　2、分組:將P3-P5細(xì)胞隨機(jī)分成四組:正常對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+高壓氧組、缺氧/復(fù)氧+高壓氧+YC-1組。缺氧/復(fù)氧處理組種板24h后倒去完全培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS沖洗1遍，更換

7、為不含血清的L-DMEM培養(yǎng)，置于95％N2、5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)9h后取出細(xì)胞，更換為5％完全培養(yǎng)基，復(fù)氧2h。正常對(duì)照組更換為完全培養(yǎng)基并置于常氧環(huán)境中培養(yǎng)。高壓氧組于復(fù)氧2h后介入。
　　3、高壓氧處理:將細(xì)胞置于高壓氧艙中，以含98％O2的混合氣體洗艙10min，關(guān)閉艙門，然后在15分鐘內(nèi)升壓至0.25，維持60min，隨之在15min之內(nèi)將艙內(nèi)壓力恢復(fù)至正常氣壓，1次/12h，連續(xù)3次。穩(wěn)壓期間艙內(nèi)平均氧濃度

8、不得低于98％。高壓氧處理同時(shí)將非高壓氧組置于同等氧艙中90min。
　　4、Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡:以3×104/ml的密度接種于6孔板，處理結(jié)束12h后棄上清，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗滌5min×2遍，向孔內(nèi)滴加入500ulHoechst33258避光染色10 min，PBS洗滌5min×3遍，熒光顯微鏡下觀察拍照。
　　5、CCK-8檢測(cè)細(xì)胞毒性及增殖:以3×104/ml將細(xì)胞種植于96孔

9、板中，每組設(shè)復(fù)孔4個(gè)，分別處理后向復(fù)孔中加入10ul CCK-8溶液，充分混勻后放入37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2h，用酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定各組吸光度，去除最大值及最小值，取其平均值后，按公式計(jì)算各組存活率，以O(shè)D值作細(xì)胞增殖曲線圖。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。
　　6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:以5×104/ml將細(xì)胞種植于60mm培養(yǎng)皿中，給予不同處理結(jié)束后吸取上清液至離心管，貼壁細(xì)胞用PBS洗滌，胰酶消化后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入相應(yīng)離心管，1000

10、r/min離心5min，收集細(xì)胞。PBS洗滌兩次后加入500μlAnnexinⅤ結(jié)合液懸浮細(xì)胞，再加入5ul AnnexinⅤ-FITC染色液，再加入5ul PI染色液室溫孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用Cell Quest軟件進(jìn)行結(jié)果分析。
　　7、Hoechst33258/PI雙染觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué):以5×104/ml將細(xì)胞種植于60mm培養(yǎng)皿中，處理結(jié)束12h后吸取上清并收集細(xì)胞，PBS調(diào)整濃度至106個(gè)/ml，取1

11、00ul細(xì)胞懸液，加入已混勻的Hoechst33258/PI(300ul∶6ul)染料，常溫下避光孵育20min，取10ul滴于載玻片，加上蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察拍照。
　　8、Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平:冰上裂解各實(shí)驗(yàn)組蛋白后，分別收集到1mlEP管中，離心(12000rpm，4℃，20 min)，用蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白濃度并調(diào)整至同一水平。依次經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗孵育、顯影及成像。凝膠成像系統(tǒng)掃描

12、并分析HIF-1α、β-catenin、LEF-1、Cl.aspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)及鑒定:
　　培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為圓形，大小不等，呈懸浮狀，其間混有大量造血干細(xì)胞。培養(yǎng)48 h換液后，顯微鏡下可見呈圓形的折光性強(qiáng)的胞體;隨著時(shí)間延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞不斷增多，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、有細(xì)小的突起，部分形成細(xì)胞集落。原代培養(yǎng)的細(xì)胞在1周左右融合達(dá)到80％-90％時(shí)可進(jìn)行傳代，此

13、時(shí)細(xì)胞呈旋渦狀或放射狀排列。傳代后細(xì)胞增殖速度增加，細(xì)胞純度較高。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD29和CD90高表達(dá)，分別為96.23+2.02％和97.28±1.3％，不表達(dá)造血干細(xì)胞特異性標(biāo)記CD45，其陽(yáng)性率為1.68±0.73％，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的一般表達(dá)情況。
　　2、Hoechst33258染色:
　　正常組中由于DNA的完整性，細(xì)胞核染色后呈均一深藍(lán)色，而缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞核由于凋亡引起DNA雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，染

14、色質(zhì)濃縮，Hoechst染色后呈亮藍(lán)色;隨著缺氧/復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡的細(xì)胞數(shù)目不斷增加，亮藍(lán)色細(xì)胞核數(shù)目也逐漸增多。
　　3、CCK-8:
　　與正常組相比，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞存活率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;給予高壓氧處理后，細(xì)胞存活率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高壓氧處理前加入YC-1阻斷劑阻斷HIF-1α表達(dá)后，細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.05);與正常對(duì)照組相比，高壓氧處理組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并無(wú)明顯增殖(P＞0

15、.05)。
　　4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例:
　　與正常組相比，缺氧/復(fù)氧組隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞發(fā)生凋亡比例逐漸增多，選取缺氧9h，復(fù)氧2h作為造模標(biāo)準(zhǔn);與缺氧/復(fù)氧組相比，給予高壓氧處理3次后，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05);高壓氧處理前加入YC-1阻斷劑阻斷HIF-1α表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。
　　5、Hoechst33258/PI雙染觀觀察細(xì)胞凋亡比例:
　　熒光顯微鏡下可見

16、，與缺氧/復(fù)氧組相比，給予高壓氧處理后，PI陽(yáng)性細(xì)胞比例有所下降（P＜0.05）;高壓氧處理前加入YC-1阻斷劑阻斷HIF-1α表達(dá)后，PI陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯升高(P＜0.05)。
　　6、Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平:
　　Western blot結(jié)果顯示缺氧/復(fù)氧后HIF-1α表達(dá)與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05);高壓氧處理能夠誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，給予YC-1阻斷劑后，HIF-1α表達(dá)明顯降低P＜0

17、.05）;和缺氧/復(fù)氧組相比，高壓氧處理組β-catenin、LEF-1表達(dá)增高，核內(nèi)β-catenin表達(dá)增高，該作用可被YC-1阻斷劑所抵消，三組之間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這說(shuō)明高壓氧可能通過(guò)HIF-1α調(diào)控Wnt通路開放，從而發(fā)揮抗凋亡能力。與正常組相比，缺氧/復(fù)氧組Cl.aspase-3表達(dá)明顯增高，同時(shí)Bcl-2表達(dá)下降，給予高壓氧處理后Cl.aspase-3表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)