大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞缺氧凋亡機制探討及Akt基因?qū)ζ淙毖醯蛲龅挠绊?pdf

1、論文一：缺氧對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡、增殖和超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 目的:
　　 探討梯度離心貼壁法培養(yǎng)的大鼠骨髓單核細胞是否MSCs以及缺氧對其凋亡、增殖和超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 方法：
　　 1.無菌條件下取出Wistar大鼠股骨及脛骨骨髓，于Percoll(比重1.074g/mL和1.070g/mL)分離液上梯度離心(500g，20 mins)后取界面層細胞培養(yǎng)、傳代。將P3 MSCs免疫細胞化學鑒

2、定CD29、CD34、CD44和CD71受體，5-aza(濃度10umol/L)培養(yǎng)液常規(guī)孵育2周后肌鈣蛋白T(troponin，Tn T)表達和H—DMEM成骨細胞誘導分化培養(yǎng)液(DEX100nmol/L，β-GP10mmol/L，AsA0.25mmol/L)常規(guī)孵育2周后ALP表達。
　　 2.將P3 MSCs置于94％N2、1％O2和5％CO2缺氧箱中37℃孵育不同時間點(常氧、缺氧0.5 h、1h、2 h、4 h和8 h

3、)。
　　 3.應用Annexin V/PI雙染法進行流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析MSCs凋亡率(Apoptotic Rate，AR)和死亡率(dead rate，DR)、應用四唑鹽比色試驗(MTT比色試驗)分析細胞增殖狀態(tài)以及透射電鏡觀察MSCs缺氧時超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.骨髓單核細胞免疫細胞化學鑒定CD29、CD44和CD71免疫細胞化學染色均可見棕黃色顆粒沉積于胞

4、膜，而CD34免疫細胞化學染色后未見棕黃色顆粒沉積于胞膜；5-aza誘導后Tn T免疫細胞化學染色可見棕黃色顆粒沉積胞質(zhì)中，成骨誘導后改良Gomori法染色可見胞漿內(nèi)深褐色甚或黑色顆粒呈片狀沉積。
　　 2.MSCs不同缺氧時間點AR和DR MSCs常氧、缺氧0.5 h、1h、2 h、4 h、和8 h時的AR均較缺氧前顯著增高(P<0.01)、DR亦顯著增高(P<0.05)，不過，隨著缺氧時間延伸，AR顯著增加(P<0.05)，

5、而DR沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 3.MSCs不同缺氧時間點增殖狀態(tài)缺氧不同時間點MTT法OD值較常氧(缺氧結(jié)束同步時間點)均顯著性降低(P<0.01)，并隨缺氧時間延伸顯著降低(P<0.05)，不過，與常氧(缺氧開始時間點)相比，均顯著升高(P<0.05)。
　　 4.缺氧對MSCs超微結(jié)構(gòu)的影響常氧時，MSCs呈卵圓形或不規(guī)則多邊形等，表面微絨毛較多且向細胞內(nèi)凹陷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體較豐富而線粒體小，多為

6、單核，雙核偶見，核仁大而形態(tài)不規(guī)則，可見核裂。缺氧0.5 h即見微絨毛脫落、胞漿空泡化、線粒體腫脹等，缺氧4 h可見腫脹線粒體(伴嵴消失)明顯增多。
　　 結(jié)論：
　　 梯度離心貼壁法培養(yǎng)的骨髓單核細胞是骨髓MSCs；缺氧可引起MSCs凋亡、增殖滯緩及超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 論文二：缺氧環(huán)境下大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達
　　 目的：
　　 探討MSCs在缺氧環(huán)境下凋亡相關(guān)基因和蛋白

7、的表達以及它們在凋亡中的潛在作用。
　　 方法：
　　 1.將接種的P3 MSCs置于94％N2、1％O2和5％CO2缺氧箱中37℃孵育。
　　 2.分別于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h取出。
　　 3.應用Annexin V/PI雙染法FCM分析MSCs凋亡率(AR)和死亡率(DR)。
　　 4.免疫細胞化學、Rt—PCR和western blotting檢測Bax

8、/Bcl-2，F(xiàn)as/FasL和Caspase-3 mRNA和蛋白的表達。
　　 5.分析AR與凋亡相關(guān)mRNA和蛋白相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.缺氧前，免疫細胞化學法未檢測到Bcl-2、Bax、Fas和Fas L蛋白表達，缺氧0.5 h后均可較強表達，各缺氧時間點Caspase-3表達率較常氧顯著增加。
　　 2.各缺氧時間點Bcl-2、Bax、Fas、Fas L、Caspase-3 mRNA和蛋

9、白表達較缺氧前均顯著增高(P均<0.05)；隨缺氧時間延伸，Bcl-2 mRNA和蛋白表達不顯著增加(P>0.05)，而Bax、Fas、Fas L、Caspase-3 mRNA和蛋白表達均顯著增加(P均<0.05)，但缺氧6 h～12 h時間點之間表達均沒有統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。
　　 3.AR和Bcl-2/Bax mRNA(r1=-0.435，P=0.040)及蛋白(r2=-0.417，P=0.043)呈顯著負相關(guān)，而

10、和Fas(r1=0.711，P=0.018：r2=0.639，P=0.025)、Fas—L(r1=0.605，P=0.037：r2=0.581，P=0.022)、Caspase-3(r1=0.657，P=0.026；r2=0.704，P=0.014)mRNA及蛋白均呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 在缺氧促進MSCs凋亡過程中，Bcl-2 mRNA和蛋白可能起著保護作用，而Bax、Fas-L、Fas、Caspase-3

11、 mRNA和蛋白可能在MSCs凋亡的進程中起著促進作用。
　　 論文三：Akt基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細胞缺氧時凋亡和增殖的影響
　　 目的：
　　 探討Akt基因是否改善MSCs耐缺氧能力。
　　 方法：
　　 將轉(zhuǎn)染Akt基因和未轉(zhuǎn)染Akt基因的MSCs置于94％N2、1％O2和5％CO2缺氧箱中37℃孵育不同時間點(常氧、缺氧0.5 h、1h、2 h、4 h和8 h)。Annexin V/PI

12、雙染法FCM分析MSCs AR和DR。應用MTT比色試驗分析細胞增殖狀態(tài)。免疫熒光細胞化學染色、Rt-PCR和western blot檢測Akt和p-Akt表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.Akt基因顯著降低MSCs缺氧時的AR和DR(P<0.01)，而在各缺氧時間點沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 2.與未轉(zhuǎn)染Akt基因的MSCs比較，Akt基因顯著增高MSCs常氧培養(yǎng)條件下(P<0.01)和缺氧培養(yǎng)條件下

13、的增殖能力(P<0.01)；轉(zhuǎn)染Akt基因的MSCs缺氧時的增殖能力顯著低于其在常氧培養(yǎng)時的增殖能力(P<0.01)。
　　 3.轉(zhuǎn)染Akt基因顯著增高常氧培養(yǎng)條件下MSCs Akt mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.01)表達，而并不增高p-Akt mRNA(P>0.05)和蛋白(P>0.05)的表達；在常氧、缺氧時Akt mRNA(P>0.05)和蛋白(P>0.05)表達均沒有統(tǒng)計學意義，而提高缺氧時p-Akt mRN

14、A(P<0.01)和蛋白(P<0.01)表達；在缺氧前、后，免疫熒光細胞化學法均可檢測到轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染Akt基因MSCs表達Akt和p-Akt蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 Akt基因轉(zhuǎn)染可顯著提高MSCs耐缺氧能力
　　 論文四：Akt基因轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細胞對阿霉素誘導的慢性心力衰竭的心臟神經(jīng)的保護作用
　　 目的：
　　 Akt-MSCs是否可調(diào)整心臟交感神經(jīng)和膽堿能神經(jīng)以及促進神經(jīng)纖維再生。

15、>　　 方法：
　　 阿霉素誘導慢性心力衰竭模型完成后，大鼠被隨機分為Akt—MSCs組(n=11)，s-MSCs(n=11)組和對照組(n=12).各組分別經(jīng)尾靜脈給予Akt—MSCs、s—MSCs(2×106 cells in100ul PBS)或等量PBS。第四周檢測心臟超聲、去甲腎上腺素(NE)，膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)、突觸素(SYN)生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)。
　　 結(jié)果：
　　 1.在

16、Akt—MSCs組和s—MSCs組，死亡率和射血分數(shù)均顯著低于對照組。
　　 2.Akt—MSCs和s—MSCs均可顯著降低組織NE水平。
　　 3.在Akt—MSCs組和s—MSCs組，ChAT水平?jīng)]有統(tǒng)計學意義，但均顯著高于對照組。
　　 4.在Akt—MSCs組和s—MSCs組，SYN或GAP-43染色陽性的神經(jīng)密度均顯著高于對照組，而以Akt-MSCs組神經(jīng)密度最高。
　　 結(jié)論：