“痰瘀同治”方藥對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及分泌VEGF的影響.pdf

1、近年來(lái)，隨著人們對(duì)組織工程及細(xì)胞治療領(lǐng)域關(guān)注度的提升，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)已成為研究的焦點(diǎn)之一。BMSCs是屬于骨髓來(lái)源的非造血干細(xì)胞，具有諸多生物學(xué)特性，如來(lái)源廣泛并易于分離擴(kuò)增、低免疫源性且不易引起免疫損傷、作為“種子”細(xì)胞具有多向分化能力、可分泌多種細(xì)胞因子并通過(guò)自分泌或旁分泌功能影響自體或其他細(xì)胞多種生物學(xué)功能并可調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)等。BMSCs應(yīng)用于心血管疾病已有大量的基礎(chǔ)及臨床研究報(bào)道。研究顯示，BMSCs可以增加梗死心

2、肌局部血流量及毛細(xì)血管密度，縮小梗死心肌面積，并在梗死心肌內(nèi)發(fā)現(xiàn)了存活的移植細(xì)胞。也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs可被招募到損傷的血管部位并分化為內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，同時(shí)對(duì)損傷血管進(jìn)行修復(fù)。而B(niǎo)MSCs通過(guò)分泌細(xì)胞因子刺激血管新生、發(fā)揮抗炎作用、誘導(dǎo)其遷移至損傷組織并參與損傷組織的修復(fù)也有大量研究報(bào)道。
　　動(dòng)脈粥樣硬化(AS)為多發(fā)病，其發(fā)生機(jī)制不清，可能與多因素、多發(fā)病環(huán)節(jié)密切相關(guān)。眾多學(xué)者認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生是動(dòng)脈對(duì)血管內(nèi)

3、皮、內(nèi)膜損傷做出的炎癥—纖維增生性反應(yīng)。而B(niǎo)MSCs的生物學(xué)特性，使其為AS臨床應(yīng)用提供可能性。
　　“痰瘀同治”方藥的主要成分為紅曲、瓜萎、薤白和三七，此前我們實(shí)驗(yàn)小組已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了動(dòng)物急性毒理實(shí)驗(yàn)和對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化影響的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，“痰瘀同治”方藥可以明顯降低血脂水平、穩(wěn)定斑塊，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展且安全無(wú)毒性作用。本實(shí)驗(yàn)擬觀察“痰瘀同治”方藥對(duì)BMSCs增殖、凋亡、遷移等方面的影響，為“痰瘀同治”方藥與BMSCs聯(lián)合

4、應(yīng)用治療AS提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　體外實(shí)驗(yàn)觀察“痰瘀同治”方藥對(duì)大鼠BMSCs增殖、凋亡、遷移及分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的影響，并初步探討B(tài)MSCs遷移的可能機(jī)制。
　　方法：
　　取4周齡SD大鼠，分離其后肢脛骨和股骨，提取全骨髓細(xì)胞。采用全骨髓貼壁法分離并培養(yǎng)大鼠BMSCs，培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。取培養(yǎng)純化至第3代后的BMSCs進(jìn)行鑒定:對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;流式細(xì)胞儀檢

5、測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD90，CD34、CD45陽(yáng)性表達(dá)率;分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)BMSCs分化，并用油紅O及茜素紅染色鑒定分化后的細(xì)胞。用20mlDMSO將10mg“痰瘀同治”方藥完全溶解，完全培養(yǎng)基將其濃度稀釋為10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L，并相應(yīng)分為10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L藥物組及對(duì)照組。用不同濃度“痰瘀同治”方藥與生長(zhǎng)

6、良好的第3代BMSCs分別干預(yù)培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h，應(yīng)用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測(cè)各組BMSCs的增殖情況，并篩選出最適藥物作用濃度及時(shí)間。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)及transwell小室檢測(cè)不同藥物濃度在最適培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)時(shí)BMSCs的凋亡情況及BMSCs的遷移能力。在最適濃度及時(shí)間點(diǎn)干預(yù)培養(yǎng)第3代BMSCs，應(yīng)用Western Blot檢測(cè)CXCR4蛋白的表達(dá)。ELISA法檢測(cè)不同干

7、預(yù)濃度培養(yǎng)的BMSCs在最適培養(yǎng)時(shí)間VEGF分泌水平。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定全骨髓貼壁方法所獲得的BMSCs培養(yǎng)14～21日即可傳代，傳代后增殖速度較原代明顯增快，7d左右可融合達(dá)80％。第3至第6代細(xì)胞純化程度高，細(xì)胞增殖能力強(qiáng);傳代后培養(yǎng)的BMSCs呈紡錘形或多角形，細(xì)胞數(shù)目多、排列緊密時(shí)可呈漩渦狀排列。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，培養(yǎng)的BMSCs均一表達(dá)CD29、CD90，陽(yáng)性率分別為98.23％

8、、98.69％;而CD34、CD45，陽(yáng)性表達(dá)率分別為2.47％、1.94％;成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs后，觀察到脂滴被紅染的細(xì)胞;成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs后，可見(jiàn)紅色礦化結(jié)節(jié)。上述結(jié)果均符合BMSCs的鑒定特征。
　　2.“痰瘀同治”方藥對(duì)BMSCs增殖及凋亡的影響以不同濃度“痰瘀同治”方藥與BMSCs共培養(yǎng)后，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定的OD值繪制增殖曲線。與對(duì)照組曲線比較，曲線上藥物濃度為10ug/L、25ug/L及5

9、0ug/L有增殖效果，曲線下藥物濃度為100ug/L及150ug/L組抑制增殖。在藥物濃度為50ug/L而培養(yǎng)時(shí)間為24h、36h、48h、60h、72h，25ug/L培養(yǎng)時(shí)間在48h、60h、72h，10ug/L培養(yǎng)時(shí)間在60h、72h時(shí)，細(xì)胞生存率均明顯高于同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;而50ug/L藥物組自36h后各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞生存率均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)的10ug/L和25ug/L藥物濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P

10、＜0.05。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，當(dāng)“痰瘀同治”方藥內(nèi)容物溶解液與BMSCs共培養(yǎng)48h后，藥物濃度為25μg/L、50μg/L時(shí)對(duì)BMSCs凋亡有顯著抑制作用，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。
　　3.“痰瘀同治”方藥對(duì)BMSCs遷移的影響“痰瘀同治”方藥藥物濃度10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L干預(yù)培養(yǎng)BMSCs48h，與對(duì)照組比較，各濃度藥物組遷移細(xì)胞數(shù)目均明顯多于對(duì)照組(P＜0.05)，其中

11、藥物濃度為50μg/L時(shí)對(duì)BMSCs的遷移促進(jìn)作用最為顯著。Western blot結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組CXCR4蛋白表達(dá)均有少量的增加，與對(duì)照組比較，50μg/L藥物干預(yù)組CXCR4蛋白表達(dá)量增高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。
　　4.“痰瘀同治”方藥對(duì)BMSCs分泌VEGF的影響當(dāng)“痰瘀同治”方藥濃度為25μg/L、50μg/L，培養(yǎng)時(shí)間為48h時(shí)，BMSCs培養(yǎng)上清液中VEGF濃度分別為（406.22±10.71）pg