人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分泌、凋亡、遷移和黏附影響因素及機(jī)制.pdf

1、骨髓干細(xì)胞是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞,利用其可分化為多種細(xì)胞的能力,可作為受損心肌組織修復(fù)的供體細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells,MSCs)是骨髓中除造血干細(xì)胞以外的另一類多能干細(xì)胞,可能成為一種理想的修復(fù)損傷心肌的移植用細(xì)胞,其治療缺血性心臟病、擴(kuò)張性心肌病等原因引起的心功能不全的研究尚處于起步階段,正日益受到關(guān)注。
　　本研究以人MSCs為研究對(duì)象,探討其增殖、旁分泌、遷移、凋

2、亡過程中不同藥物的影響,及相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
　　第一部分，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化
　　[目的]：分離并培養(yǎng)人MSCs,純化擴(kuò)增,為進(jìn)一步進(jìn)行藥物干預(yù)研究打基礎(chǔ),并檢測(cè)細(xì)胞表型。使用5-氮雜胞苷(5-azacytidine,5-aza)將人MSCs向心肌細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化,進(jìn)行細(xì)胞鑒定,以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。
　　[方法]：抽取志愿者骨髓液,使用密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,并借助MSCs黏附

3、于塑料瓶底這一特性進(jìn)行純化。相差顯微鏡觀察形態(tài)變化,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD105、CD106表面抗原表達(dá),鑒定MSCs。將MSCs傳代擴(kuò)增培養(yǎng),取第6代MSCs經(jīng)5-aza誘導(dǎo)分化,相差顯微鏡觀察形態(tài)變化,免疫化學(xué)鑒定細(xì)胞誘導(dǎo)前后肌球蛋白重鏈β和心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponinT,cTnT)表達(dá)。
　　[結(jié)果]：將密度梯度離心法與貼壁法相結(jié)合,可獲得較多的MSCs,通過傳代后細(xì)胞進(jìn)一步純化,每個(gè)25cm2細(xì)胞

4、培養(yǎng)瓶接種2×105個(gè)細(xì)胞,完全培養(yǎng)液胎牛血清濃度為10％,80%～90%細(xì)胞融合后按1:3或1:2比例傳代,MSCs能穩(wěn)定地傳代擴(kuò)增而無明顯分化跡象。原代細(xì)胞培養(yǎng)2周左右可首次傳代,以后7d左右傳代一次,傳到第6代未發(fā)現(xiàn)屬性改變,呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)。應(yīng)用5-aza對(duì)第6代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化2周,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變大,連接緊密,呈條索狀,外表似心肌細(xì)胞,誘導(dǎo)前MSCs肌球蛋白重鏈β和cTnT表達(dá)均陰性,誘導(dǎo)后則均為陽性表達(dá),陽性細(xì)胞率約為2

5、1%。
　　[結(jié)論]：應(yīng)用密度梯度離心法密度梯度離心法與貼壁法相結(jié)合,可建立人MSCs體外穩(wěn)定的純化擴(kuò)增方法。體外5-aza誘導(dǎo)后2周,MSCs從形態(tài)和蛋白表達(dá)水平上向心肌細(xì)胞方向分化,符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　第二部分，促紅細(xì)胞生成素、普伐他汀、紅景天苷、抗血小板藥物對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、旁分泌和分化的干預(yù)研究
　　[目的]：觀察重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human EPO,rhEPO)、普伐他汀、

6、紅景天苷、抗血小板藥物干預(yù)對(duì)人MSCs增殖、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌、分化的影響。
　　[方法]：體外擴(kuò)增培養(yǎng)人MSCs,繪制生長(zhǎng)曲線,使用上述藥物干預(yù)第6代人MSCs,相差顯微鏡觀察藥物作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte trazoliumbromide,MTT]

7、比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedim munosorbentassay,ELISA)法測(cè)定細(xì)胞VEGF分泌,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞抗原CD34、CD105、CD106表達(dá)變化,免疫化學(xué)觀察藥物預(yù)處理后經(jīng)5-aza誘導(dǎo),人MSCscTnT抗體染色陽性細(xì)胞率的變化。
　　[結(jié)果]：(1)細(xì)胞增殖情況:傳代細(xì)胞潛伏期為48h左右,對(duì)數(shù)增殖期約為接種后第4～6d,至接種后第7d進(jìn)入平臺(tái)期。經(jīng)藥物作用后的人MS

8、Cs形態(tài)和細(xì)胞表面抗原CD34、CD105、CD106表達(dá)無明顯變化。反映MSCs增殖變化的OD570值在一定濃度rhEPO(0.01U/mL～10U/mL)、普伐他汀(0.2μmol/L～10μmol/L)、紅景天苷(0.2mg/L～2mg/L)、氯吡格雷(0.02μmol/L～40μmol/L)和噻氯匹定(0.02μmol/L～40μmol/L)作用后明顯高于對(duì)照組(P<0.05),而部分濃度的阿司匹林組(60μmol/L～2000

9、μmol/L)則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。(2)細(xì)胞VEGF分泌:人MSCs分泌的VEGF水平在高濃度紅景天苷(5mg/L)、高濃度氯吡格雷(40μmol/L)和噻氯匹定(40μmol/L)作用后明顯低于對(duì)照組(P<0.01),而低濃度普伐他汀(0.2μmol/L)、阿司匹林組和低濃度氯吡格雷組(0.02μmol/L)VEGF水平與對(duì)照組無明顯差異,rhEPO、高濃度普伐他汀(100μmol/L)、低濃度紅景天苷(0.2mg/L)

10、和低濃度噻氯匹定(0.02μmol/L)VEGF水平則顯著高于對(duì)照組。(3)細(xì)胞分化情況:細(xì)胞表面抗原CD34、CD105、CD106在6種藥物作用后與對(duì)照組相比無明顯差異。促紅細(xì)胞生成素、普伐他汀、紅景天苷、氯吡格雷、噻氯匹定和阿司匹林預(yù)處理后經(jīng)5-aza誘導(dǎo),人MSCscTnT單克隆抗體染色陽性細(xì)胞百分率無明顯變化(P值分別為0.597、0.952、0.325、0.141、0.830和0.072)。
　　[結(jié)論]：rhEPO、

11、普伐他汀、紅景天苷、氯吡格雷和噻氯匹定對(duì)人MSCs有明顯的促進(jìn)增殖作用,而阿司匹林則抑制其增殖。高濃度紅景天苷、氯吡格雷和噻氯匹定有抑制人MSCs分泌VEGF的作用,rhEPO、高濃度普伐他汀、低濃度紅景天苷和低濃度噻氯匹定可促進(jìn)VEGF分泌。這些藥物對(duì)人MSCs的分化影響不明顯。
　　第三部分:促紅細(xì)胞生成素和普伐他汀對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、旁分泌、凋亡、遷移和黏附的影響和作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　[目的]：觀察促紅細(xì)胞生

12、成素和普伐他汀干預(yù)對(duì)人MSCs增殖、VEGF分泌、凋亡、遷移和黏附的影響及相關(guān)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　[方法]：體外培養(yǎng)人MSCs,使用上述藥物干預(yù)第6代人MSCs,Westernblot方法檢測(cè)作用前后磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellula rsignal-regulated kinase1/2,ERK1/2)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen activated protein kinase,

13、p38MAPK)及磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threoninekinase,Akt)蛋白的表達(dá)情況,進(jìn)一步用特異的細(xì)胞信號(hào)通路抑制劑或激動(dòng)劑阻斷或激活ERK1/2、p38MAPK及PI3K/AKT途徑,通過MTT法測(cè)定對(duì)人MSCs的增殖影響,ELISA法測(cè)定細(xì)胞VEGF的分泌,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行rhEPO和普伐他汀對(duì)MSCs的抗凋亡研究

14、,Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),并進(jìn)行細(xì)胞黏附性測(cè)定。
　　[結(jié)果]：rhEPO和普伐他汀可使人MSCs的PI3K/Akt通路磷酸化水平升高,抑制p38MAPK通路磷酸化水平,對(duì)人MSCs的ERK通路和總Akt、總p38MAPK水平無明顯影響。經(jīng)p38MAPK通路特異激動(dòng)劑anisomycin預(yù)處理后,rhEPO組促增殖作用較前減弱(P<0.05),而普伐他汀組作用消失,PI3K/AKT通路特異抑制劑Ly294002預(yù)處

15、理影響不明顯。Ly294002或anisomycin預(yù)處理均可使rhEPO促進(jìn)人MSCs分泌VEGF的作用減弱(P<0.01),Ly294002預(yù)處理可使普伐他汀的這種作用減弱(P<0.01),但anisomycin作用不明顯。rhEPO和普伐他汀能降低H2O2誘導(dǎo)的人MSCs凋亡(P<0.01),Ly294002預(yù)處理后這種作用消失,anisomycin預(yù)處理對(duì)這種作用影響不明顯。經(jīng)rhEPO或普伐他汀作用后遷移細(xì)胞顯著增多(P<0.

16、01),Ly294002預(yù)處理后這種作用消失,anisomycin預(yù)處理對(duì)這種作用影響不明顯。經(jīng)rhEPO或普伐他汀作用后貼壁細(xì)胞顯著增多(P<0.01),但Ly294002或anisomycin預(yù)處理對(duì)這種作用影響均不明顯。
　　[結(jié)論]：rhEPO及普伐他汀可促進(jìn)人MSCs的增殖、分泌VEGF、遷移和黏附能力,并具有抗凋亡作用。這兩種藥物的促進(jìn)增殖作用與其抑制p38MAPK通路有關(guān),p38MAPK通路受抑制也與rhEPO促進(jìn)V