力生長(zhǎng)因子對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和遷移的影響及相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞,在特定環(huán)境誘導(dǎo)條件下,MSCs可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞類(lèi)型,在損傷組織的修復(fù)和再生中起著重要作用。MSCs從骨髓中動(dòng)員、進(jìn)入外周血循環(huán)向損傷組織位點(diǎn)定向遷移是其行使損傷組織修復(fù)功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。研究發(fā)現(xiàn),多種力學(xué)、化學(xué)因素在MSCs向損傷組織位點(diǎn)遷移過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用。<

2、br>　　力生長(zhǎng)因子(Mechano-growth factor,MGF)是胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)基因選擇性剪接產(chǎn)生的一種變異體,在多種組織/細(xì)胞中表達(dá),具有力敏感性。研究證實(shí),MGF能夠激活衛(wèi)星細(xì)胞、促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖,在治療肌肉缺損、預(yù)防心肌損傷和修復(fù)受損神經(jīng)等方面起著重要作用。
　　目前,人們對(duì)于MGF如何影響MSCs的相關(guān)生物學(xué)行為還缺乏全面認(rèn)識(shí),其中涉及的

3、分子機(jī)理更不清楚。因此,本文采用一種合成的大鼠MGF羧基端25個(gè)氨基酸組成的E肽(MGF-C25E),考察了MGF-C25E對(duì)大鼠MSCs(rat MSCs,rMSCs)增殖和遷移行為的影響特征及相關(guān)機(jī)理。該研究工作的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1)rMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定結(jié)合密度梯度離心法和差時(shí)貼壁法從大鼠骨髓中分離rMSCs,用含10％胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)、傳代,顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀檢查細(xì)胞表面相關(guān)抗原的表達(dá)

4、和細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示,分離的細(xì)胞接種后12-24h即可貼壁,形成漩渦狀集落,細(xì)胞多呈梭型,鋪展形態(tài)良好,7-10天生長(zhǎng)近融合。流失細(xì)胞分析結(jié)果顯示,CD34呈陰性表達(dá),CD90和CD44呈陽(yáng)性表達(dá)。細(xì)胞周期分布中,絕大多數(shù)細(xì)胞(94.23±0.84％)處于G0/G1期,符合干細(xì)胞周期分布的特征。
　　2)MGF-C25E對(duì)rMSCs增殖行為的影響通過(guò)MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法分別考察了MGF-C25E對(duì)rMSCs增殖行為的影響。結(jié)果

5、顯示,10-70 ng/mL的MGF-C25E處理rMSCs24-96h,與相應(yīng)對(duì)照組比較,都未發(fā)現(xiàn)rMSCs增殖行為有明顯變化。結(jié)果提示,在研究的濃度和作用時(shí)間條件下,MGF-C25E對(duì)rMSCs的增殖沒(méi)有明顯影響。
　　3)MGF-C25E對(duì)rMSCs遷移行為的影響采用Transwell法考察了MGF-C25E對(duì)rMSCs遷移的影響。結(jié)果顯示,10-100ng/mL的MGF-C25E都能促進(jìn)rMSCs的遷移能力,在50ng/m

6、L濃度刺激下達(dá)到峰值,隨后遷移能力出現(xiàn)回落,但仍然顯著高于對(duì)照組。結(jié)果證實(shí),MGF-C25E能明顯促進(jìn)rMSCs的遷移。
　　3)MGF-C25E促進(jìn)rMSCs遷移行為的分子機(jī)理RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MGF-C25E作用后rMSCs SDF-1基因及其受體CXCR4基因的表達(dá)上調(diào)。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),CXCR4蛋白水平的表達(dá)上調(diào)(p<0.05)。CXCR4抑制劑AMD3100抑制了MGF-C25E誘導(dǎo)的CXCR

7、4表達(dá)上調(diào),也抑制了MGF-C25E促進(jìn)的rMSCs遷移。
　　MGF-C25E處理rMSCs后ERK1/2磷酸化水平顯著上調(diào)(p<0.05),ERK1/2抑制劑PD98059抑制了MGF-C25E對(duì)ERK1/2的激活,同時(shí)廢除了MGF-C25E誘導(dǎo)的rMSCs遷移。此外,AMD3100也抑制了MGF-C25E誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化上調(diào),消除了MGF-C25E促進(jìn)的rMSCs遷移。結(jié)果提示,MGF-C25E可能通過(guò)SDF-1/C

8、XCR4-ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)rMSCs的遷移。
　　4)MGF-C25E促進(jìn)rMSCs遷移行為的細(xì)胞力學(xué)機(jī)理進(jìn)一步采用原子力顯微鏡和免疫熒光染色方法分析了MGF-C25E作用下細(xì)胞力學(xué)特性和骨架的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MGF-C25E處理rMSCs后,細(xì)胞的楊氏模量增加,細(xì)胞骨架F-actin聚合。AMD3100或PD98059預(yù)處理可消除MGF-C25E對(duì)rMSCs楊氏模量和F-actin的影響。上述結(jié)果表明,MGF-C25E可