缺氧誘導因子-1α對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞低氧環(huán)境下功能的影響.pdf

1、缺血性心臟病是人類死亡的主要病因之一。急性嚴重的心肌缺血導致心肌細胞壞死，壞死的心肌細胞不可再生，而被纖維組織所代替，出現(xiàn)心肌重塑、心功能下降，逐步惡化的心功能促使惡性心律失常、心臟驟停等嚴重心臟事件發(fā)生，最終導致死亡。因此，人們一直在找尋一方法挽救壞死或瀕臨壞死的心肌。盡管急診再灌注治療能夠降低急性心?；颊叩脑缙谒劳雎什⒏纳祁A后，但仍無法逆轉(zhuǎn)心梗后心肌重塑而致的心功能不全。通過細胞移植技術將供體干細胞植入受損的心肌組織中，生長并重建心

2、肌以代替纖維組織，同時誘導血管新生，改善心臟功能，為治療急性心肌梗死提供了一種全新的策略[1]。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow stem cells，MSCs)是骨髓中除造血干細胞以外的另一類干細胞類型，具有自我更新和多向分化潛能，已證實這類細胞在合適的體內(nèi)外特定條件下可向成骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、皮膚和肝等多種類型的成熟細胞分化[2～11]。它取材方便、容易分化、易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達[12-14]，無免疫原性，無倫理

3、問題。越來越多的證據(jù)支持成人干細胞具有多向分化能力而適于心肌、血管的再生治療[15]，MSC是目前應用于細胞移植治療的較理想的種子細胞[16，17]。已有研究證明心肌梗死后應用MSC移植治療能夠改善心功能，減緩心肌重塑，促進血管新生，而且MSC在移植區(qū)域的存活可使其所攜帶的基因穩(wěn)定表達，但由于在梗死心肌局部的氧氣或營養(yǎng)物質(zhì)供需失調(diào)，MSC的生存能力不足，制約了MSC在心肌梗死部位的存活和分化。
　　 缺氧誘導因子-1(hypox

4、ia induced factor-1，hif-1)是一種參與機體缺氧調(diào)節(jié)的重要細胞因子，它通過調(diào)節(jié)代謝、改善供給等提高細胞和組織的耐缺氧能力。Hif-1由hif-1a和hif-1β兩個亞基組成，其中hif-1a是它的活性部分。已有研究證明hif-1a能夠改善缺氧心肌的功能，但未能證明轉(zhuǎn)染hif-1a的缺血心肌組織能夠穩(wěn)定表達hif-1a，因此hif-1a的作用可能轉(zhuǎn)瞬即逝。
　　 Hif-1a對細胞低氧時凋亡具有雙向調(diào)節(jié)的特點

5、。我們假設hif-1a能夠減少MSC低氧時的凋亡，改善MSC缺氧時的生存力和細胞功能，而以MSC作為載體hif-1a在缺氧環(huán)境可持續(xù)高表達，那末轉(zhuǎn)染hif-1a的MSC則能夠顯著減緩心梗后心肌重塑、縮小心肌壞死面積。本研究擬觀察hif-1a對MSC在低氧時生存和功能的影響，以此作為基礎在體實驗中對比分析hif-1a對MSC移植治療心梗效果的影響和機制。本研究的創(chuàng)新在于將聯(lián)合應用hif-1a和MSC治療大鼠急性心肌梗死作為研究目標，而目前

6、與此相關的研究目前還很少，我們希望本研究能為急性心梗的治療的探索做出貢獻。
　　 目的：
　　 通過對比應用不同方法、不同血清濃度的培養(yǎng)基在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)中的效果，篩選大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的最佳分離培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基的血清濃度。觀察低氧時hif-1a轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的MSC增殖分化的差異，探討Hif-1a對MSC在低氧環(huán)境中的影響。比較不同情況下(hif-1a轉(zhuǎn)染的MSC移植后、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC移植后、MSC移

7、植后、未行細胞移植)急性心梗大鼠梗死心肌面積、缺血區(qū)毛細血管的新生及心肌重塑的變化，探討hif-1a對MSC移植治療大鼠急性心梗效果的影響，并淺析其機制。
　　 材料與方法：
　　 Wistar大鼠處死后分別應用直接貼壁法、密度梯度離心法分離大鼠MSC，常規(guī)換液及少量換液方法行細胞培養(yǎng)，并比較在10％、11%、15%不同血清濃度時大鼠MSC的生長狀態(tài)、細胞數(shù)量和群體倍增時間。P3代細胞行細胞表面抗原和細胞分化功能鑒定。應

8、用脂質(zhì)體作為載體將HIF-1a轉(zhuǎn)染至P3代MSC，熒光觀察GFP表達，評估轉(zhuǎn)染效率。應用G418對轉(zhuǎn)染細胞行穩(wěn)定篩選，應用有限稀釋法對篩選后細胞行單克隆培養(yǎng)。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSC和未轉(zhuǎn)染的MSC置于低氧環(huán)境下，比較三種細胞生長狀態(tài)等方面的差異，并檢測HIF-1amRNA、VEGFmRNA、HIF-1a蛋白和VEGF蛋白的表達。應用結扎冠狀動脈前降支方法制作大鼠心肌梗死模型，將大鼠隨機分成假手術組、單純心梗組、心梗+MS

9、C移植組及心梗+HIF-1a轉(zhuǎn)染MSC移植組，每組取8只大鼠用于結果觀察，細胞移植組于心梗模型成功即刻在梗死心肌及其周圍行細胞移植。術后4周將大鼠處死后分離心臟，稱重，測量左室心腔大小，左室心肌厚度，應用HE染色的方法觀察心肌結構、梗死心肌局部及周圍毛細血管新生，免疫熒光染色觀察移植細胞在心肌局部的分布，westernblot方法檢測心肌HIF-1a蛋白和VEGF蛋白的表達。
　　 結果：
　　 分別應用直接貼壁法+常規(guī)

10、換液、直接貼壁法+少量換液、密度梯度離心法+常規(guī)換液、密度梯度離心法+少量換液的方法分離培養(yǎng)大鼠MSC，細胞的平均倍增時間分別為36.0±0.9小時、23.5±1.1小時、49.8±1.2小時、48.0±0.8小時。MSC在分離后3-10天形成集落，呈漩渦狀生長。血清濃度篩選試驗中發(fā)現(xiàn)11%為MSC生長的最適血清濃度。免疫組化方法細胞表面抗原鑒定CD45(-)，CD90(+)；流式細胞儀分析MSC細胞表面抗原表達CD450.38%，CD

11、9098.4%。P3代MSC可以成功向成骨細胞及脂肪細胞誘導分化。
　　 應用脂質(zhì)體法可以成功將pcDNA3.0-HIF-1a-eGFP轉(zhuǎn)染至MSC，轉(zhuǎn)染效率21%。經(jīng)G418篩選、應用有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC單細胞克隆。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC仍具有向脂肪細胞及軟骨細胞分化的能力，且在低氧條件下(CoCl2模擬缺氧)pcDNA3.0-HIF-1a-eGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC較空質(zhì)粒(pcDNA3.0-eGFP)轉(zhuǎn)染的MSC和未轉(zhuǎn)染

12、的MSC凋亡率下降(P<0.05)，增殖旺盛(P<0.05)，并能高表達hif-1a mRNA及蛋白(P<0.05)、VEGF mRNA及蛋白(P<0.05)。
　　 大鼠急性心梗模型手術成功率為37%。HIF-1a轉(zhuǎn)染的MSC移植組移植細胞成活率顯著高于其他各組(P<0.05)。術后4周時HIF-1a轉(zhuǎn)染的MSC移植組大鼠的心臟重量、左心室腔大小顯著低于其他3組(P<0.05)，左室心肌厚度顯著高于其他組(P<0.05)，梗死

13、心肌及其周圍毛細血管增生較其他組顯著增加(P<0.05)。HIF-1a轉(zhuǎn)染的MSC移植組大鼠心肌顯著高表達HIF-1a蛋白(P<0.05)及VEGF蛋白(P<0.05)。
　　 結論：
　　 應用直接貼壁法和少量換液方法分離培養(yǎng)的MSC增殖快。11%應為MSC生長的較適血清濃度。
　　 Hif-1a穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MSC在低氧時高表達hif-1a蛋白、hif-1a mRNA、VEGF蛋白和VEGFmRNA。Hif-1a