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文檔簡(jiǎn)介
1、目的和意義: 個(gè)體化治療的發(fā)展使兒童急性白血?。ˋcute leukemia, AL)的療效大大提高。藥物代謝和腫瘤細(xì)胞的關(guān)系密切。研究提示柔紅霉素(Daunorubicin,DNR)能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞系凋亡,同時(shí)有活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS )水平的改變。本課題主要研究?jī)和毙粤馨图?xì)胞白血病(Acute lymphocyte leukemia, ALL)個(gè)體之間的ROS水平與DNR細(xì)胞毒作用
2、的關(guān)系,為個(gè)體化治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 采用淋巴細(xì)胞分離液分離出AL細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞的固有ROS、DNR(50、100、500ng/ml)、大黃素(Emodin,E)10uM/L和聯(lián)合用藥(E10uM/L +DNR50ng/ml)誘導(dǎo)24小時(shí)后的 ROS水平,每次以U937細(xì)胞的ROS值作對(duì)照;誘導(dǎo)48小時(shí)后,用四甲基偶氮唑鹽(Methyl-thiazol-te
3、trazolium,MTT)法檢測(cè)以上各組及DNR100ng/ml和N-乙酰-L-半胱氨酸(Nacetylcysteine, NAC)10mM/L 聯(lián)合用藥后的細(xì)胞相對(duì)活力;運(yùn)用FCM和hoechst33342-PI染色法觀察凋亡現(xiàn)象。 結(jié)果: 1、11例兒童ALL細(xì)胞的固有ROS水平與DNR 的IC50呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。在14例兒童AL 中(其中11例ALL,3例急性髓系白血?。╝cute myeloid le
4、ukemia,AML)),細(xì)胞的固有ROS水平與DNR IC50也呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。 2、11例ALL細(xì)胞的固有ROS水平之間有差異(p<0.05)。以U937細(xì)胞的ROS值為對(duì)照,其固有ROS水平為0.2602±0.1178,11例經(jīng)50ng/ml、9例經(jīng)100ng/ml、7例經(jīng)500ng/ml的DNR誘導(dǎo)24小時(shí)后,ROS分別為0.2908±0.1315,0.2849±0.1254和0.2565±0.0987。DNR
5、50、100ng/ml時(shí)ROS上升(p<0.05),而DNR500ng/ml時(shí)與固有ROS水平無(wú)差別,但較DNR100ng/ml時(shí)有下降(p<0.05)。在15例AL細(xì)胞中(11例ALL,4例AML),經(jīng)DNR50、100ng/ml誘導(dǎo)后ROS水平也上升,至DNR500ng/ml時(shí)開(kāi)始下降(p<0.05)。 3、11例ALL細(xì)胞經(jīng)DNR(50、100、500ng/ml)誘導(dǎo)48小時(shí)后細(xì)胞相對(duì)活力隨著濃度的升高而下降,分別為75.
6、45±18.02%,53.85±18.76%和41.54±21.23%(p<0.05)。14例AL細(xì)胞(11例ALL,3例AML)經(jīng)以上濃度誘導(dǎo)后,細(xì)胞活力亦逐漸下降(p<0.05)。 4、在5例AL細(xì)胞中,經(jīng)NAC10mM/L 與DNR100ng/ml聯(lián)合用藥48小時(shí)后,細(xì)胞相對(duì)活力顯著升高(p<0.05),從單用DNR100ng/ml的56.33±17.46%上升到104.63±22.19%。 5、DNR誘導(dǎo)ALL細(xì)
7、胞后,F(xiàn)CM和hoechst33342-PI染色均檢測(cè)到凋亡和壞死,并隨著濃度的增加凋亡增多。 6、以U937細(xì)胞的ROS值為對(duì)照,10例ALL細(xì)胞的固有ROS水平為0.2587±0.1294,經(jīng)DNR50ng/ml、E10uM/L 和DNR50ng/ml+E10uM/L 聯(lián)合用藥24小時(shí)后ROS分別為0.2941±0.1447,0.3159±0.1522和0.3421±0.1706,均能增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平(p<0.05),且
8、聯(lián)合用藥比DNR單用具有更高的ROS水平(p<0.05)。12例AL細(xì)胞(10例ALL,2例AML)中,以上各組亦能增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平(p<0.05)但聯(lián)合用藥與DNR單用的ROS水平無(wú)明顯差異(p>0.05)。 7、11例ALL細(xì)胞經(jīng)E10uM/L 誘導(dǎo)48小時(shí)后,細(xì)胞相對(duì)活力為102.17±14.45%,無(wú)明顯的細(xì)胞毒性(P>0.05),聯(lián)合用藥組比DNR組具有更強(qiáng)的細(xì)胞抑制率,細(xì)胞活力從75.45±18.01%下降到58
9、.22±19.16%( p<0.05);兩藥相互作用指數(shù)(Combination index,CI)<1,具有協(xié)同作用( p<0.05),且能達(dá)到DNR100ng/ml的抑制效果(P>0.05)。在14例AL中(11例ALL,3例AML),得出的結(jié)果同ALL。 8、11例ALL中耐藥組(IC50> 225.77ng/ml)和敏感組(IC50<225.77ng/ml)的固有ROS水平分別為0.1811±0.0765和0.3065±
10、0.0594,兩者有顯著性差異(p<0.01)。DNR50ng/ml聯(lián)用E10uM/L 后,耐藥組細(xì)胞活力由88.82±11.68%下降到73.18±13.12% ,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而敏感組細(xì)胞抑制率無(wú)明顯上升(P>0.05)。在14例AL中(11例ALL,3例AML),結(jié)果同ALL。 9、ALL細(xì)胞經(jīng)DNR合用E后,形態(tài)學(xué)上觀察到凋亡現(xiàn)象增強(qiáng)。 10、與臨床危險(xiǎn)度分析得出:在19例ALL患兒中,高危組的固
11、有ROS水平低于低危組(P<0.05)。固有ROS水平與性別、年齡、免疫分型、初發(fā)時(shí)外周血白細(xì)胞數(shù)、藥物影響、潑尼松反應(yīng)和第19天骨髓幼稚數(shù)無(wú)關(guān);兒童初發(fā)ALL細(xì)胞的固有ROS水平(0.2801±0.1206)低于AML(0.4197±0.1374),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論: 1、ALL和AL細(xì)胞固有ROS水平與DNR的細(xì)胞毒性正相關(guān)。 2、ALL個(gè)體固有ROS水平之間有差異。DNR誘導(dǎo)ALL和AL
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